NMR-Spektroskopische Untersuchungen der Imidazolglycerinphosphat-Synthase HisF aus Thermotoga maritima: Studien zur Bindung von Effektormolekülen und Xenon sowie zum pKa-Wert katalytisch aktiver Aminosäurereste

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	10 August 2011
Referee:	Prof. Dr. Eike Brunner and Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer
Date of exam:	16 July 2010
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Alumni or Retired > Prof. Dr. Eike Brunner
Interdisciplinary Subject Network:	Not selected
Keywords:	HisF, Thermotoga maritima, NMR, 14N, NAD, backbone assignment, inorganic phosphate, ImGP, ProFAR, pKa, Asp11, 129Xe, channelling, cavities, Zuordnung, Kavitäten
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	16128

Abstract (German)

Die Imidazol Glycerol Phosphat (ImGP) Synthase aus Thermotoga maritima wird aus zwei Untereinheiten gebildet, die als HisH und HisF bezeichnet werden. Die ImGP-Synthase katalysiert einen der elf Schritte der Histidinbiosynthese. HisF benötigt den durch die Glutaminase-Untereinheit HisF produzierten Ammoniak für die Bildung von ImGP aus PRFAR, wobei zusätzlich AICAR entsteht. HisH ist nur in der ...

Abstract (German)

Die Imidazol Glycerol Phosphat (ImGP) Synthase aus Thermotoga maritima wird aus zwei Untereinheiten gebildet, die als HisH und HisF bezeichnet werden. Die ImGP-Synthase katalysiert einen der elf Schritte der Histidinbiosynthese. HisF benötigt den durch die Glutaminase-Untereinheit HisF produzierten Ammoniak für die Bildung von ImGP aus PRFAR, wobei zusätzlich AICAR entsteht. HisH ist nur in der Gegenwart von effektorgebundenem HisF aktiv. Alle bekannten Effektormoleküle (PRFAR, ProFAR, ImGP) binden über Phosphatgruppen an HisF.
In der vorliegenden Arbeit wurde NAD als neues Effektormolekül identifiziert. Darüber hinaus wurde eine Zuordnung der chemischen Verschiebungen des Proteinrückgrates von HisF in Gegenwart von anorganischem Phosphat angefertigt. Phosphat bindet zwar an HisF, wirkt jedoch nicht als Effektor. Die Ergebnisse wurden mit den Auswirkungen der Bindung von NAD, ImGP und ProFAR im 1H 15N HSQC Spektrum verglichen.
Der pKa-Wert des katalytisch essentiellen Asp11 wurde in Abwesenheit und Gegenwart von anorganischem Phosphat bestimmt, welches als Modell für die Bindung eines Liganden dient.

Es wird angenommen, dass der produzierte Ammoniak vom aktiven Zentrum von HisH durch einen intramolekularen Tunnel zum Zentrum von HisF transportiert wird. Diese Hypothese wurde mit Hilfe der Xenon-NMR-Spektroskopie und Titration mit Ammoniumchlorid untersucht. Die Ergebnisse waren mit einem schrittweisen Transport durch den intramolekularen Tunnel von HisF vereinbar.

Translation of the abstract (English)

The imidazole glycerole phosphate (ImGP) synthase from hyperthermophilic Thermotoga maritima is composed of the subunits HisH and HisF. It catalyzes one step within the eleven steps biosynthesis of the amino acid histidine. The glutaminase subunit HisH produces nascent ammonia which is used in the subsequent cleavage of PrFAR catalyzed by HisF to form AICAR and the histidine precursor ImGP. ...

Translation of the abstract (English)

The imidazole glycerole phosphate (ImGP) synthase from hyperthermophilic Thermotoga maritima is composed of the subunits HisH and HisF. It catalyzes one step within the eleven steps biosynthesis of the amino acid histidine. The glutaminase subunit HisH produces nascent ammonia which is used in the subsequent cleavage of PrFAR catalyzed by HisF to form AICAR and the histidine precursor ImGP. HisH is only active in the presence of both HisF and bound effector molecules (e.g. PRFAR, ProFAR, ImGP). All effector molecules bind to HisF via phosphate moieties.
In the present work NAD has been identified as a new effector molecule with the help of natural abundance 14N NMR spectroscopy. Moreover, the backbone resonances of HisF were assigned in the presence of inorganic phosphate which binds to HisF but does not act as an effector. The results were compared to ligand binding studies with NAD, ImGP and ProFAR employing 1H 15N HSQC experiments.
The pKa of catalytic essential Asp11 was determined in the presence and absence of inorganic phosphate as a mimic for a bound ligand.
It has been proposed that nascent ammonia is transported from the active site of HisH through an intramolecular channel to the active site of HisF. We tried to find experimental evidence for this hypothesis using xenon NMR spectroscopy and 1H 15N HSQC titration studies with ammonium chloride. Our results were consistent with a stepwise transport through HisF’s intramolecular channel.

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