| License: Publishing license for publications including print on demand (10MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-164302
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.16430
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 3 September 2010 |
| Referee: | Prof. Dr. Armin Buschauer |
| Date of exam: | 6 August 2010 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | Neuropeptid Y, NPY, Y Rezeptor, G-Protein gekoppelter Rezeptor, GPCR, Radioaktivität, Konstitutive Aktivität, Calcium Assay, Fluoreszenz, Aequorin, FRET, Epac; neuropeptide Y, G protein-coupled receptor, radioactivity, constitutive activity, fluorescence |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 16430 |
Abstract (English)
For the pharmacological characterization of GPCR ligands in addition to binding data, the determination of the quality of action, agonistic potency or antagonistic activity is a must. There are numerous methods to determine potency and efficacy of ligands at the GPCR of interest, each of which has its specific applications, advantages and disadvantages. Therefore, a maximum of information on a ...
Abstract (English)
For the pharmacological characterization of GPCR ligands in addition to binding data, the determination of the quality of action, agonistic potency or antagonistic activity is a must. There are numerous methods to determine potency and efficacy of ligands at the GPCR of interest, each of which has its specific applications, advantages and disadvantages. Therefore, a maximum of information on a given GPCR is obtained by combining complementary approaches. This thesis aimed at the development of functional assays exploiting FRET-, bioluminescence- and radioactive techniques.
The FRET-based cAMP biosensor Epac2-camps was expressed in SK-N-MC cells to establish an assay to identify potential Y1R ligands in High Throughput Screening. Thereby changes in the CFP/YFP signal ratio due to altered intracellular cAMP levels in response to adenylyl cyclase stimulation with forskolin and inhibition via Y1R activation are measured. Spectra of SK-N-MC-Epac2-camps cells were recorded in suspension and background corrected. Upon treatment with forskolin and the PDE inhibitor IBMX, the CFP/YFP ratio, calculated from intensities of the maximum emission peaks, increased. According to theory, this is because the fluorophores move away from each other due to unfolding of the protein upon binding of cAMP. The initial results were irreproducible, presumably due to poor stable transfection efficiency and low Epac2-camps expression. Therefore the same experiment was conducted on single cells using a confocal microscope equipped with a Meta detector for spectrum acquisition. However, meaningful changes in ratios were not observed, although adequate cAMP formation in SK-N-MC cells was shown previously by conventional methods. Thus, further investigation of Epac2-camps was discontinued.
HEC-1B-hY5 cells, stably expressing the hY5R, were considered a suitable starting point to develop functional fluorescence- and bioluminescence-based Ca2+ assays. While only small Ca2+ transients were measured in a flow cytometric assay upon stimulation with pNPY in these cells, a robust signal was elicited, when the cells were expressing Gαqi5. This effect was receptor specific, because it was inhibited by the Y5R antagonist CGP 71683A. The concentration response curve of pNPY revealed an EC50 comparable to values reported in literature. Since the expression of chimeric G protein declined over time, the parent cells were newly transfected with Gαqi5 and Gαqi9, respectively. All resulting transfectants showed only poor Ca2+ mobilization in flow cytometric and fluorimetric measurements, though high pNPY concentrations were used. In an additional approach, HEC-1B-hY5 Gαqi5/9 cells were transfected with mitochondrially targeted apoaequorin and tested for their ability to emit luminescence upon treatment with the non ionic detergent, triton-X-100. Signals were only obtained from cells expressing Gαqi9. The measured response was weak compared to that obtained with CHO cells, stably expressing hY2/4R, Gαqi5 and mtAEQ. Thus, an aequorin assay for the hY5R was not fully established. Nevertheless, optimization of the generation and selection of stable HEC-1B-hY5 transfectants might pave the way for versatile functional calcium assays.
Finally, with the establishment of a steady-state GTPase assay a classical radioactive technique was applied. For this purpose, baculoviruses encoding the sequences of hY2R and hY4R were generated. Functional reconstitution of the receptors with different members of the Gi/o protein family and RGS proteins in Sf9 insect cells enabled the determination of coupling efficiencies to G proteins and the identification of the best co-expression systems to yield robust stimulation and high signal to noise ratios. Evaluation of membranes, expressing hY2R + Gαi2 + Gβ1γ2, hY4R + Gαi2 + Gβ1γ2 + RGS4 and hY4R + Gαo1 + Gβ1γ2 + RGS4, was performed with peptidergic agonists and non-peptidic antagonists (Y2R) yielding pharmaco-logical data in good agreement with values reported in literature. The hY4R stimulated GTPase activity proved to be sensitive to monovalent cations, indicating moderate con-stitutive receptor activity. Interestingly, only the hY4R showed a pronounced decrease in molecular weight and a loss of function, when expressed in the presence of tunicamycin, which inhibits N-glycosylation. The hY2R was much less affected. Thus, with the steady-state GTPase assay a well characterized system and a very useful model to search for potent Y2 and Y4 antagonists and inverse agonists has been established.
Translation of the abstract (German)
Für die pharmakologische Charakterisierung von GPCR Liganden ist zusätzlich zu Bindungsdaten die Bestimmung der Art ihrer Aktivität und ihrer agonistischen bzw. antagonistischen Potenz unerlässlich. Zahlreiche Methoden zur Bestimmung der Potenz und Effizienz solcher Liganden haben alle ihre spezifischen Anwendungsgebiete sowie Vorteile und Nachteile. Deswegen kann ein größtmöglicher ...
Translation of the abstract (German)
Für die pharmakologische Charakterisierung von GPCR Liganden ist zusätzlich zu Bindungsdaten die Bestimmung der Art ihrer Aktivität und ihrer agonistischen bzw. antagonistischen Potenz unerlässlich. Zahlreiche Methoden zur Bestimmung der Potenz und Effizienz solcher Liganden haben alle ihre spezifischen Anwendungsgebiete sowie Vorteile und Nachteile. Deswegen kann ein größtmöglicher Informationsgewinn über einen bestimmten GPCR nur durch die Kombination komplementärer Herangehensweisen erreicht werden. Diese Arbeit hatte die Entwicklung funktioneller Testsysteme unter Anwendung verschiedener Techniken wie FRET, Biolumineszenz und Radioaktivität zum Ziel.
Für die Etablierung eines Assays zur Identifizierung potentieller Y1R Liganden im Hochdurchsatz-Screening wurde der FRET-basierte cAMP-Biosensor Epac2-camps in SK-N-MC Zellen exprimiert. Über die Änderungen des CFP/YFP Signalverhältnisses werden veränderte intrazelluläre cAMP-Spiegel erfasst z. B. wenn die Adenylylzyklase über Forskolin stimuliert bzw. über den Y1R inhibiert wird. Dazu wurden Spektren von SK-N-MC-Epac2-camps Zellen in Suspension aufgenommen und gegen die Autofluoreszenz nicht transfizierter Zellen korrigiert. Nach Zugabe von Forskolin und dem PDE-Inhibitor IBMX stieg das CFP/YFP-Verhältnis an, das aus den Intensitäten der Emissionsmaxima berechnet wurde. Laut Theorie lässt sich dies mit der Linearisierung des Sensors nach der Bindung von cAMP begründen, die zur Folge hat, dass sich die Fluorophore voneinander weg bewegen. Die anfänglichen Ergebnisse ließen sich jedoch nicht reproduzieren, vermutlich wegen der geringen Transfektioneffizienz und der niedrigen stabilen Expression von Epac2-camps. Auch in der Einzelzellbetrachtung mit einem Konfokalmikroskop, das mit einem Meta-Detektor ausgestattet ist, wurden keine bedeutenden Änderungen im CFP/YFP Verhältnis beobachtet, obwohl eine genügend hohe cAMP Produktion unter obengenannten Bedingungen in SK-N-MC Zellen früher schon mit konventionellen Methoden gezeigt worden ist. Weitere Untersuchungen mit Epac2-camps wurden eingestellt.
Stabil transfizierte HEC-1B-hY5 Zellen dienten als Ausgangspunkt für die Entwicklung Fluoreszenz- und Lumineszenz-basierter Ca2+-Assays. Nach der Transfektion mit dem chimeren G-protein Gαqi5 zeigte sich im durchflusszytometrischen Assay mit pNPY ein robustes Ca2+-Signal, das mit dem selektiven Y5R Antagonisten, CGP 71683A unterdrückt werden konnte. Die Ermittlung des EC50 für pNPY in diesem Experiment ergab einen mit Literaturdaten übereinstimmenden Wert. Da die Expression des chimären G-proteins mit der Zeit abnahm, wurden Zellen erneut mit Gαqi5 und mit Gαqi9 transfiziert. Die Ca2+-Signale in durchflusszytometrischen und fluorimetrischen Assays waren jedoch niedrig. Weiterhin wurden die Zellen mit mitochondrialem Aequorin (mtAEQ) transfiziert und nach Zugabe von Triton-X-100, einem nichtionischen Tensid, bezüglich Luminesz untersucht. Nur die Zellen, welche Gαqi9 exprimierten, lieferten ein Lumineszenz-Signal, jedoch verglichen z. B. mit CHO-hY2/4-Gαqi5-mtAEQ-Zellen. in viel geringerem Maße Somit war ein funktioneller Aequorin Assay für den hY5R nicht realisierbar. Dennoch eröffnet die Optimierung der Transfektionsbedingungen und der Selektion geeigneter Transfektanten möglicherweise Wege zu vielseitigen funktionellen Calcium-Assays.
Schließlich wurde bei der Etablierung eines GTPase-Assays eine klassische radiochemische Methode angewandt. Zu diesem Zweck wurden Baculoviren, die die Sequenzinformationen des hY2 bzw. hY4 Rezeptors enthalten, generiert. Die funktionelle Rekonstitution der Rezeptoren mit unterschiedlichen Vertretern von Gi/o- und RGS-Proteinen in Sf9 Insektenzellen ermöglichte die Ermittlung der Kopplungseffizienz zu unterschiedlichen G-Proteinen sowie die Identifizierung der besten Koexpressionssysteme mit robuster Stimulierung und hohem Signal-Rausch-Verhältnissen. Die Evaluierung der Membran-Präparationen, hY2R + Gαi2 + Gβ1γ2, hY4R + Gαi2 + Gβ1γ2 + RGS4 und hY4R + Gαo1 + Gβ1γ2 + RGS4, erfolgte mit peptidischen Agonisten sowie nicht peptidischen Antagonisten (hY2R) und ergab pharmakologische Daten, die mit Werten aus der Literatur im Einklang stehen. Die hY4R vermittelte GTPase-aktivität wurde durch monovalente Salze gestört, was auf eine moderate konstitutive Rezeptoraktivität hinweist. Interessanterweise zeigte nur der hY4R eine deutliche Abnahme im Molekulargewicht und den vollständigen Verlust der Rezeptor-funktion, wenn er in Anwesenheit von Tunicamycin, einem Inhibitor der N-Glykosylierung, exprimiert wird. Der hY2R ist davon weitaus weniger betroffen. Mit der Etablierung des GTPase-Assays steht ein gut charakterisiertes System und sehr nützliches Modell für die Suche nach potenten Y2R- und Y4R-Antagonisten sowie inversen Agonisten zur Verfügung.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 15:17
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