Abstract (English)
Glycerophospholipid and sphingolipid species and their bioactive metabolites are important regulators of lipoprotein and cell function. Aim of the study was to develop a method for lipid species profiling of separated lipoprotein classes.
Methods: Human serum lipoproteins VLDL, LDL and HDL of 21 healthy fasting blood donors were separated by fast performance liquid chromatography (FPLC) from 50 ...
Abstract (English)
Glycerophospholipid and sphingolipid species and their bioactive metabolites are important regulators of lipoprotein and cell function. Aim of the study was to develop a method for lipid species profiling of separated lipoprotein classes.
Methods: Human serum lipoproteins VLDL, LDL and HDL of 21 healthy fasting blood donors were separated by fast performance liquid chromatography (FPLC) from 50 μl serum. Subsequently, phosphatidylcholine, lysophosphatidyl¬choline, sphingo-myelin, ceramide, phosphatidylethanolamine, phosphatidylethanolamine-based plasmalogen, cholesterol and cholesteryl ester content of the separated lipoproteins was quantified by electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS).
Results: Analysis of FPLC fractions with polyacrylamide gel electrophoresis demonstrated that albumin partially co-elutes with HDL fractions. However, analysis of an HDL deficient serum (Tangier disease) showed that only lysophosphatidylcholine, but none of the other lipids analyzed, exhibited a significant co-elution with the albumin containing fractions. About 60% of serum ceramide were found in LDL fractions and 60% of phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine and plasmalogens in HDL fractions. VLDL, LDL and HDL displayed characteristic lipid class and species pattern.
Conclusion: The developed method provides a detailed lipid class and species composition of lipoprotein fractions and may serve as a valuable tool to identify alterations of lipoprotein lipid species profiles in disease with a reasonable experimental effort.
Translation of the abstract (German)
Cholesterin, Glycerophospho- und Sphingolipide und deren aktive Metaboliten sind wichtige Komponenten und Regulatoren des Lipoprotein- und Zellstoffwechsels. Phosphatidylcholin und Sphingomyelin dienen als Vorläufer der Verbindungen Lysophospatidylcholine bzw. Ceramide und regulieren darüber hinaus zentrale Schritte des Lipoproteinstoffwechsels. Neben der direkten Wirkung dieser Lipide auf den ...
Translation of the abstract (German)
Cholesterin, Glycerophospho- und Sphingolipide und deren aktive Metaboliten sind wichtige Komponenten und Regulatoren des Lipoprotein- und Zellstoffwechsels. Phosphatidylcholin und Sphingomyelin dienen als Vorläufer der Verbindungen Lysophospatidylcholine bzw. Ceramide und regulieren darüber hinaus zentrale Schritte des Lipoproteinstoffwechsels. Neben der direkten Wirkung dieser Lipide auf den Zell- und Lipidstoffwechsel wurden in den letzten Jahren außerdem Glycerophosphlipid- und Sphingolipidspezies im Serum als Biomarker verschiedenster Krankheiten diskutiert.
Ziel der Arbeit war deshalb die Entwicklung einer Methode zur schnellen und umfangreichen Analyse des Gehalts an Cholesterin, Sphingo- und Glycerophospholipiden in den humanen Serumlipoproteinen VLDL, LDL and HDL, welche die zentralen lipidtransportierenden Partikel im Serum darstellen.
Methode und Ergebnisse:
Aus 50μl Serum wurden mit Hilfe einer Superose 6 FPLC-Chromatographiesäule in einem ersten Schritt die humanen Serumlipoproteine VLDL, LDL und HDL herausgetrennt und fraktioniert. In einem zweiten Schritt wurden diese Fraktionen nach Delipidierung auf Cholersterin-, Phosphatidylcholin-, Lysophophatidylcholin-, Phosphatidylethanolamin-, Sphyngomyelin, Ceramid- und Plasmalogengehalt mit Hilfe einer ESI-MS/MS Massenspektrometrieplatform untersucht.
Nach Validierung und Etablierung dieser Methode wurde sie einem ersten Praxistest unterzogen. Dabei wurde die Lipidzusammensetzung der Serumlipoproteine von 21 gesunden, nüchternen Blutspendern untersucht.
Es wurde gezeigt, dass sich im gesunden, nüchternen Menschen etwa 60% des gesamten Lipoprotein assozierten Ceramides im LDL und etwa 60% von Phosphatidylcholin, Phosphatidyletanolamine und Plasmalogenen im HDL befindet. Die drei Lipoproteinklassen VLDL, LDL und HDL zeigten außerdem charakteristische Phospho- und Sphyngolipidspecieszusammensetzungen. Zusätzlich konnte durch Analyse eines HDL-defizienten Patientenserums (Tangier Disease) bestätigt werden, dass einer der FPLC basierten Trennung von Lipoproteinen, Albumin teilweise mit den HDL enthaltenden FPLC Fraktionen co-eluiert. Wie bereits aus der Literatur bekannt, konnten wir zeigen, dass ausschließlich Lysophosphatidylcholine jedoch keines der anderen untersuchten Lipide zusammen mit Albumin co-eluieren und eine Beeinflussung unserer Messergebnisse damit ausgeschlossen ist.
Fazit:
Mit 50μl Probenvolumen, geringer Probenaufbereitungs- und Analysezeit und der Möglichkeit eines hohen Probendurchsatzes ist diese Methode äußerst wertvoll zur schnellen Quantifizierung von Cholesterin-, Sphingo- und Phospholipidgehalt der human Serumlipoproteine. Neben der Verwendung für Grundlagenforschung und klinische Studien zur Identifizierung von Abnormalitäten im Cholesterin-, Glycero- und Sphyngolipidstoffwechsel bei lipidassoziierten Erkrankungen, ist außerdem der Einsatz der Methode in der Routinediagnostik möglich.
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