| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen mit Print on Demand Dissertation - Johannes Polz (2MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-170908
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.17090
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 27 Oktober 2010 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Daniela Männel und PD Dr. Thomas Langmann |
| Tag der Prüfung: | 30 September 2010 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Immunologie Biologie und Vorklinische Medizin |
| Themenverbund: | Nicht ausgewählt |
| Stichwörter / Keywords: | Tumor necrosis factor (TNF), TNF receptor type 2 (TNFR2), inflammation, sepsis, myeloid derived suppressor cells (MDSC), nitric oxygen synthetase type 2 (iNOS), arginase type 1 (Arg1), nitric oxygen (NO), bone marrow derived dendritic cells (BMDC), myeloid cells, macrophages |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 17090 |
Zusammenfassung (Englisch)
Sepsis is a serious medical condition that is characterized by a whole-body inflammatory state and the presence of a known or suspected infection Dr. Theo Sterns reported that TNFR2 deficient mice were protected from a secondary infection during the phase of sepsis that is usually characterized as sepsis-induced immunosuppression The results shown and discussed in this work reveal several ...
Zusammenfassung (Englisch)
Sepsis is a serious medical condition that is characterized by a whole-body inflammatory state and the presence of a known or suspected infection Dr. Theo Sterns reported that TNFR2 deficient mice were protected from a secondary infection during the phase of sepsis that is usually characterized as sepsis-induced immunosuppression The results shown and discussed in this work reveal several cellular phenotypes of TNFR2-/- myeloid cells and allow to draw conclusions about the function of TNFR2 in general and especially in sepsis. It was shown that CLP is required to induce iNOS mRNA expression and NO production in CD11b+ CD11c- cells upon stimulation with LPS and IFN-ү and that the lack of TNFR2 results in a reduction of both iNOS mRNA expression and NO production. This cellular phenotype was also found in other myeloid cells such as PEC and BMDC from naïve mice. BMDC were used as a cellular model for further investigations. TNFR2-/- BMDC produce reduced concentrations of IL-6 upon stimulation with LPS and IFN-ү. These findings indicate that TNFR2-signaling is required for adequate NO and IL-6 production.
It turned out that missing TNFR2 decreased the proliferation in these cells leading to reduced cell yields at day 10 of the BMDC differentiation culture. In combination with data from TNFR1-/- BMDC TNFR2 expression was shown to be required for adequate proliferation. TNFR2-/- BMDC cultures showed reduced proportions of MDSC throughout the cultivation period. TNFR2-/- BMDC as well as TNFR2-/- BMDC sorted for the MDSC marker Ly6C+ Ly6G- showed reduced Arg1 mRNA expression indicating an important role of TNFR2 in the generation and function of MDSC. TNFR2 signaling seems to be essential for adequate generation of MDSC and could contribute to the suppressive functions of these cells in dampening inflammation in vivo. The hypothesis that TNFR2-/- cells ex vivo or in vitro contain a higher percentage or more activated MDSC could not be proven.
TNFR2-/- BMDC cultures contained increased proportions of activated (MHCII+ CD80+ CD86+) cells at day 8 and day 10 indicating less suppression of T cell proliferation and, simultaneously, improved antigen presentation and, thus, better activation of T cells. These are strong indications for a dampening function of TNFR2 in the immune system as its presence seems to be required for the downregulation of activation molecules.
Whether direct TNFR2-signaling or indirect effects via enhanced TNFR1-signaling as a consequence of the missing TNF antagonist soluble TNFR2 are responsible for the phenotypes of TNFR2-/- myeloid cells has been investigated using bone marrow chimeric mice and mixed BMDC cultures. It has been shown that the phenotypes of TNFR2-/- myeloid cells remain stable in BMDC from wildtype host mice that were reconstituted with TNFR2-/- bone marrow and, thus, generating wildtype conditions for a TNFR2-/- hematopoietic system. These phenotypes also persisted in TNFR2-/- BMDC in mixed BMDC differentiation cultures initially containing wildtype and TNFR2-/- bone marrow in equal proportions. This culture method generates equal environmental conditions for both types of BMDC. As TNFR2-/- BMDC of both bone marrow chimeric mice and mixed BMDC differentiation cultures maintained the phenotypes found for TNFR2-/- BMDC, this is a very strong indication for a missing intrinsic signaling via TNFR2 and, thus, confirms the hypothesis of an important role of direct TNFR2-signaling in the immune system. Additionally, these results reveal that reverse signaling via soluble or membrane-bound TNFR2 as ligand and membrane-bound TNF as receptor can be excluded as the reason for these phenotypes as the conditions are equal for TNFR2-/- and wildtype BMDC in mixed BMDC differentiation cultures.
However, epigenetic promoter or histone modifications could also be the cause for the TNFR2-/- phenotypes described in this work since altered TNFR1-signaling in TNFR2-/- mice cannot be excluded completely as the TNF antagonist soluble TNFR2 is missing in these mice.
Mouse anti-mouse TNFR2 mAB were generated and tested for binding as well as agonistic and antagonistic properties. The antibodies performed positive in ELISA and Western blot and one clone also stained TNFR2-expressing cells in FACS analysis. However, neither agonistic nor antagonistic functions could be detected in a cytotoxicity assay established to detect specific TNFR2 activation by using cells expressing the extracellular domain of TNFR2 fused to the intracellular domains of human Fas.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Das Krankheitsbild der Sepsis geht im Zusammenhang mit Sekundärinfektionen häufig mit hoher Morbidität und Mortalität einher und ist daher ein wichtiges Themengebiet der angewandten biomedizinischen Forschung. Dr. Theo Sterns hat 2005 in seiner Doktorarbeit beschrieben, dass die Abwesenheit von TNF-Rezeptor Typ-2 (TNFR2) im Mausmodell für Sepsis, der CLP-induzierten Peritonitis, einen Schutz vor ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Das Krankheitsbild der Sepsis geht im Zusammenhang mit Sekundärinfektionen häufig mit hoher Morbidität und Mortalität einher und ist daher ein wichtiges Themengebiet der angewandten biomedizinischen Forschung. Dr. Theo Sterns hat 2005 in seiner Doktorarbeit beschrieben, dass die Abwesenheit von TNF-Rezeptor Typ-2 (TNFR2) im Mausmodell für Sepsis, der CLP-induzierten Peritonitis, einen Schutz vor einer folgenden Zweitinfektion bewirkt. Ziel dieser Arbeit war es, diesen in vivo Befund auf myeloide Zellen zu übertragen, um nachvollziehen zu können, ob in diesem zellulären System TNFR2-vermittelte Mechanismen einen Einfluss auf die Pathogenese der Sepsis haben.
Es stellte sich heraus, dass CD11b+ CD11c- Zellen aus der Milz nach Restimulation mit LPS und IFN-ү erst dann in der Lage sind, Stickoxid (NO) zu produzieren, wenn die Maus mit einer CLP vorbehandelt wurde, und, dass die Zellen aus TNFR2-/- Tieren bedeutend weniger NO produzieren. Das NO-Produktionsdefizit zeigte sich auch in weiteren myeloiden Zellen sogar aus naiven TNFR2-/- Tieren, wie z.B. in peritonealen Exsudatzellen (PEC) und Dendritischen Zellen, welche in vitro aus knochenmarkständigen Vorläuferzellen generiert wurden (BMDC).
Am Modell der BMDC wurde das Fehlen von TNFR2 detailliert untersucht. Es zeigte sich, dass BMDC von TNFR2-/- Mäusen eine reduzierte IL-6-Produktion nach Restimulation mit LPS und IFN-ү aufweisen. Die Zellausbeute und Proliferation von TNFR2-/- BMDC ist jedoch bei gleicher Sterblichkeitsrate reduziert. In Zusammenhang mit erhöhten Proliferationsraten bei TNFR1-/- BMDC, welche von der Arbeitsgruppe um Lutz auch als „unsterblich“ beschrieben wurden, ist dies ein starkes Indiz für ein TNFR2-vermitteltes Proliferationssignal. BMDC von TNFR2-/- Tieren zeigten in der späten Phase der Differenzierung zu BMDC einen höheren Anteil an Zellen, welche die Aktivierungsmarker MHCII, CD80 und CD86 trugen. Der Anteil der myeloiden Suppressorzellen (MDSC) hingegen war während der ganzen Differenzierung erniedrigt. Dies ist ein Indiz dafür, dass in TNFR2-/- Zellsystemen die T-Zell-Antwort verbessert abläuft, da einerseits die Antigen präsentierenden Zellen eine bessere Antigenpräsentation aufweisen und zusätzlich eine reduzierte Suppressivität vorherrscht. TNFR2 scheint somit eine suppressive Funktion für T-Zellen zu vermitteln.
Da löslicher TNFR2 große Mengen an löslichem TNF biologisch inaktiveren kann, wurde die Frage geklärt, ob die beschriebenen Effekte auf intrinsischen TNFR2 Signalen beruhen, oder ob sie über veränderte TNF-Konzentrationen TNFR2 vermittelt sind. BMDC aus Knochenmark-chimären Wildtyp Mäusen, welche mit TNFR2-/- Knochenmark rekonstituiert wurden, zeigten weiterhin reduzierte NO-Produktion und einen erhöhten Anteil an Aktivierungsmarkern. BMDC Kulturen, welche zu Beginn der Differenzierung aus 50% Wildtyp und 50% TNFR2-/- Knochenmarkszellen zusammengesetzt wurden, gewährleisteten identische Konzentrationen an löslichem TNF und löslichem TNFR2 für beide Populationen. Die TNFR2-/- BMDC aus diesen Kulturen wiesen alle Phänotypen auf, die auch für TNFR2 /- Reinkulturen gezeigt wurden: reduzierte NO und IL-6 Produktion, sowie ein erhöhter Anteil an Aktivierungsmarkern bei einem erniedrigten Prozentsatz an MDSC. Dies ist ein starkes Indiz dafür, dass das Fehlen intrinsischer Signale in TNFR2-/- BMDC für diese Befunde verantwortlich ist und Umgebungseffekte über lösliches TNF während der Kultur eine untergeordnete Rolle spielen. Epigenetische Modifikationen in TNFR2-/- Systemen, welche womöglich bereits sehr früh in der Ontogenese über das Fehlen intrinsischer TNFR2- oder auch über verstärkte TNFR1- Signale induziert werden, können in diesen Modellen letztendlich als Ursache für die erwähnten Phänotypen nicht ausgeschlossen werden. Um eine Klärung dieser Frage zu ermöglichen, wurden monoklonale Antikörper gegen TNFR2 generiert, um mittels möglicherweise blockierender Antikörper den TNFR2-/- Phänotyp in vitro nachahmen zu können und somit einen endgültigen Beweis für das Fehlen intrinsischer TNFR2-Signale zu erbringen. Es konnte jedoch weder agonistische noch antagonistische Funktionalität in einem speziell entwickelten zelluläreren Assay basierend auf Fusionsproteinen aus den Extrazellulardomänen von TNFR1 und TNFR2 und der Intrazellulardomäne von humanem Fas nachgewiesen werden.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 15:18
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