| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen mit Print on Demand (3MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-182246
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.18224
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 26 November 2010 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Otto Wolfbeis und Prof. Dr. Joachim Wegener |
| Tag der Prüfung: | 18 November 2010 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Chemo- und Biosensorik (Prof. Antje J. Bäumner, ehemals Prof. Wolfbeis) |
| Themenverbund: | Nicht ausgewählt |
| Stichwörter / Keywords: | Microarray, Immunoassay, antibody, Staphylococcus aureus, enterotoxin, dairy, milk, cheese, fluorescence, toxin |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 18224 |
Zusammenfassung (Englisch)
In the first part of the work, an array on a competitive assay for the detection of Staphylococcus aureus Enterotoxins SEA-SED and SEH in milk products was developed due to the regulations of the project “BIOTRACER”. The fluorescence intensity of Cy3 was detected with an array scanner at 562 nm emission wavelength. The goal to design the competitive array within the desired dynamic range of ...
Zusammenfassung (Englisch)
In the first part of the work, an array on a competitive assay for the detection of Staphylococcus aureus Enterotoxins SEA-SED and SEH in milk products was developed due to the regulations of the project “BIOTRACER”. The fluorescence intensity of Cy3 was detected with an array scanner at 562 nm emission wavelength. The goal to design the competitive array within the desired dynamic range of 0.1-10 ng/mL for all five toxins was not achieved. The unspecifity of the available antibodies and problems with the silanization of the array depicted permanent challenges within the scope of this research.
First of all, well-known cleaning methods for glass slide were tested with regard to their surface coating quality and different silanization methods were applied. The quality was considered as acceptable for array design by means of fluorescence and contact angle measurements. All five antibody types were labeled with Cy3 to quantify the binding of antibody with immobilized toxin. Multiple labeling experiments with variation in pH, molar ratio, cleaning procedure, kind of fluorescence dye and labeling time were proceeded to achieve an optimal dye-to-protein ratio and therefore the best fluorescence intensity. The Melon Gel Kit was adjudged optimal for the removal of high concentrations of unbound fluorescence dye.
First trials for antigen occupancy on amino-silanized glass slides, nitrocellulose slides and epoxy-silanized glass slides with hydrophobic pattern yielded in acceptable results for the last two slide types. Amino slides were eliminated for further experiments due to the circumstantial handling and the poor reproducibility of the intensity values. The nitrocellulose slides exhibited very poor signal-to-noise ratio and high backgrounds which complicated scanning and analysis of the slides extensively. As a next step, the optimal concentration of labeled primary antibodies should be identified for the antigen layer of a primary system. This can be considered as difficile. Despite to identical optimization strategies, the antibodies had extremely differing characteristics and therefore very different antibody concentrations were necessary for reaching similar intensities. Only the concentrations for <SEA> and <SEB> were identical, which was proven on Nitrocellulose Slides too.
Fluorescence normalization was necessary for each array because of the disparities in concentration and fluorescence intensity. Furthermore, the normalization had to be integrated in all array analyses. As a next step, different competitive concentration rows were made for all toxin types and with differing toxin concentrations. Linear concentration ranges were achieved after several trials, indeed they are not within the requested concentration ranges. Within the primary system there are significant noticeable problems for all toxin types and slide types: high standard deviations between 15 and 30%, poor reproducibility of the linear ranges of single toxin types, low signal-to-noise ratios and often high background when using Fast Slides. These problems could not be overcome, so Nitrocellulose Slides were eliminated for further measurements. The results of the calibration rows in milk were identically to those in PBS buffer, which build the base of the array. An application of real samples was made as closure for the experiments within the primary system. Therefore, untreated and artificially contaminated milk samples from Switzerland were used. In principle, real samples are applicable to the array system with limitations in insufficient linear ranges. Subsequent, a first secondary system was established. The given antigen layer and primary antibody concentrations were kept constant, only the labeled antibody was changed against an unlabeled one. Detection was carried out with a secondary, Cy3-labeled polyclonal antibody. The goal of this step was the removal of the necessity of fluorescence normalization. Within competitive tests, proper intensity and variance values were achieved, with limitation in the insufficient linear ranges.
Another secondary system was established, but with completely new parameters for every layer. This leaded to acceptable intensities, signal-to-noise ratios and deviations repeatedly. However, the linear range could not be decreased either. Furthermore, both system types were tested for the cross-reactivity of their antibodies. The primary system exhibits a high cross reactivity which could be partially attributed to different labeling efficiencies and intensities that were not removable by normalization. The secondary system exhibits relatively low and almost optimal cross reactivities. Finally, the array is not ready to achieve the desired linear range, but the corner stone is made and the system was already tested with real samples.
Second part of this work was the development of a competitive SPR sensor platform for the detection of Staphylococcus aureus Enterotoxins in milk. Based on a self-assembling monolayer on the gold surface of a SPR chip, SEA and SEB were reproducibly immobilized and the interaction with the corresponding antibodies was characterized. A competitive assay was used to establish calibration curves in a real sample. Furthermore, it was possible to determine the toxin concentration in milk directly. Further optimization and analysis of the system seems to be necessary. At the moment, it is not explained, how modified monolayers behave with regard to immobilization and unspecific binding.
A decreasing proportion of carboxyl groups and exchange of them through hydroxyl groups could be an example. The cross reaction of different antibody-toxin couples was already tested on the array and was proven to be optimal for secondary systems. The specifications have to be carried forward to the SPR system to enable multi-toxin measurements on one chip. Optimization in time management is advised. Complete toxin detection in milk samples takes 50 minutes, including all washing steps and requiring a completely prepared sensor chip. Compared to conventional methods like ELISA, SPR seems to be a time-saving method, but HPLC is comparably powerful or faster. Coupling of the starting slope of the kinetic curve with the concentration could be a starting-point. The analysis of the previous conclusion allows suppose of a simple dependency, which could reduce the measuring time. Costoptimization could be another point. At the moment, all immobilizations are done with 50 mg/L. This might be possible with lower concentrations and without enormously prolonged reaction time.
In summary, important mile stones, such as LOD and processing time, for the newly developed specific SPR sensor platform of the Enterotoxins are taken as a base herein, butfurther optimization and variation is neccessary.
Remarkably, SPR spectroscopy is versatile and conformatory and competes with other methods in analytics and sensor technology.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Im ersten Teil der Arbeit wurde auf Basis der Vorgaben des EU-Projektes „BIOTRACER“ ein kompetitiver Mikroarray zur Bestimmung der Staphylococcus-aureus-Enterotoxine SEA-SED und SEH in Milchprodukten entwickelt. Die Fluoreszenz-intensität des Farbstoffes Cy3 wurde mit Hilfe eines Array-Scanners bei 562 nm Emissionswellenlänge detektiert. Das Ziel, den kompetitiven Array im gewünschten dynamischen ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Im ersten Teil der Arbeit wurde auf Basis der Vorgaben des EU-Projektes „BIOTRACER“ ein kompetitiver Mikroarray zur Bestimmung der Staphylococcus-aureus-Enterotoxine SEA-SED und SEH in Milchprodukten entwickelt. Die Fluoreszenz-intensität des Farbstoffes Cy3 wurde mit Hilfe eines Array-Scanners bei 562 nm Emissionswellenlänge detektiert. Das Ziel, den kompetitiven Array im gewünschten dynamischen Bereich von 0,1-10 ng/mL für alle fünf Toxintypen zu entwickeln, konnte nicht erreicht werden. Im Rahmen dieser Arbeit stellten die relativ unspezifischen Antikörper sowie Probleme bei der Mikroarray-Beschichtung nicht lösbare Herausforderungen im gegebenen Zeit- und Finanzerungsrahmen dar.
Zunächst wurde die bestehende Reinigungsmethode für Glasslides hinsichtlich ihrer Qualität getestet und verschiedene Silanisierungsmethoden appliziert. Mit Hilfe von Fluoreszenz- und Kontaktwinkelmessungen an den silanisierten Slides konnte die Qualität als ausreichend für den Aufbau des Arrays befunden werden. Um die Bindung zwischen Antikörper und dem immobilisierten Toxin quantifizieren zu können, wurden alle Antikörper mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy3 markiert. Mehrere Ansätze mit Varianz in pH, molarem Quotienten, Aufreinigungsmethode, Alternativfarbstoff und Markierungszeiten wurden durchgeführt, um ein optimales Farbstoff-zu-Protein-Verhältnis und damit die beste Fluoreszenzintensität zu erhalten. Zur Abtrennung hoher Konzentrationen ungebundenen Farbstoffes wurde das Melon Gel Kit als optimal befunden.
Erste Versuche zur Belegung der Antigenschicht mit Amino-silanisierten Glasslides, Nitrocellulosemembran-basierten Fast-Slides und Epoxysilanisierten Glasslides mit hydrophober Maske ergaben gute Ergebnisse für die letzten beiden Typen. Die Aminoslides schieden für das weitere Procedere aufgrund des umständlichen Handlings und der schlechten Reproduzier-barkeit aus. Auffällig war bei den Nitrocellulose-Slides das sehr niedrige Signal-zu-Rausch-Verhältnis und der oft sehr hohe Hintergrund, der das Scanning und die Auswertung der Slides erheblich erschwerte. Im nächsten Schritt sollte für die gegebene Antigenschicht des primären Systems die optimale Konzentration an markiertem Primärantikörper ermittelt werden. Dies stellte sich als diffizil heraus, da trotz gleicher Optimierungsstrategie die Antikörper extrem unterschiedliche Eigenschaften aufwiesen und daher zum Erlangen relativ ähnlicher Intensitäten sehr unterschiedliche Konzentrationen notwendig waren. Einzig die Konzentration für <SEA> und <SEB> konnte als gleich angenommen werden, auch auf den Nitrocellulose-Slides lies sich dies bestätigen. Bedingt durch die Unterschiede in Konzentration und Fluoreszenzintensität musste für den Array eine Fluoreszenznormierung gemacht werden, die anschließend rechnerisch in jeden Array Einzug halten musste.
Im nächsten Schritt wurden verschiedene Konzentrationsreihen an kompetitiven Toxingehalten und Toxinsorten durchgeführt. Nach mehreren Versuchen ergaben sich lineare Bereiche, die allerdings ausserhalb des geforderten Bereiches liegen. Immer wieder auffällig sind im primären System bei allen Toxinarten und Slidetypen die relativ hohen Standardabweichungen zwischen 15 und 30% und die schlechte Reproduzierbarkeit der linearen Bereiche der einzelnen Toxinarten.
Des weiteren konnte das niedrige Signal-zu-Rausch-Verhältnis und der oft sehr hohe Hintergrund bei den Nitrocellulose-Slides nicht verbessert werden, was letztendlich zum finalen Ausschluss dieses Slide-Typs für weitere Experimente führte. Ergebnisse der Kalibrationsreihen in Milch zeigten identische Ergebnisse zu jenen in Puffer, die die Basis für den Array bilden. Als Abschluss der Experimente des primären Systems mit markierten primären Antikörpern wurde eine Applikation mit realen Proben durchgeführt. Dafür wurde unbehandelte und künstlich kontaminierte Rohmilch aus einer Probensammlung in der Schweiz verwendet. Prinzipiell, aber nur sehr eingeschränkt, funktioniert das Arraysystem auch mit der Realprobe, zeigt aber wieder die Schwächen des ungenügenden dynamischen Bereiches auf.
Im Anschluss an die Messungen mit Realproben wurde das erste sekundäre System etabliert, in dem die Konzentrationen für Antigen- und Antikörperschicht beibehalten wurden, lediglich der markierte Antikörper wurde durch einen nicht markierten ersetzt und die Detektion mittels eines Cy3-gelabelten Sekundär-antikörpers durchgeführt. Ziel dieses Ersatzes war die Eliminierung der Fluoreszenznormierung, da nur ein Sekundärantikörper notwendig ist. Hinsichtlich Intensität und Varianz ergaben sich gute Werte für diese System im kompetitiven Test, jedoch war der lineare Bereich wiederholt ungenügend. Als nächster Schritt wurde ein weiteres sekundäres System etabliert, jedoch mit komplett neuen Konzentrationsparametern in jeder Schicht. Dies führte wiederholt zu guten Intensitäts- und Signal-zu-Rausch-Verhältnissen und zu niedrigeren Fehlern. Jedoch ließ sich der dynamische Bereich weiterhin nicht senken. Das primäre und das sekundäre System wurden des weiteren auf die Kreuzreaktivität ihrer verwendeten Antikörper getestet. Im Falle des Primärsystems ergab sich eine hohe Kreuzreaktivität, die teilweise auch auf die unterschiedlichen Markie-rungseffizienzen und Intensitäten zurückzuführen ist und auch mittels Normierung nicht zu beseitigen war. Im Sekundärsystem waren die Kreuzreaktivitäten relativ niedrig, beinahe optimal.
Letztendlich ist der dynamische Bereich des Arrays noch in größeren Konzentrationsbereichen als der gewünschte linearen Bereich, jedoch ist der Grundstein gelegt und das System bereits an einer Realprobenreihe getestet.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein Vergleichssensor zur Bestimmung von Staphylococcus-aureus-Enterotoxinen in Milch auf Basis der Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie entwickelt.
Durch Auftragung einer selbst-organisierenden Monoschicht auf der Oberfläche eines mit Gold beschichteten Glaschips konnten die Toxine SEA und SEB reproduzierbar immobilisiert und deren Bindung mit den entsprechenden Antikörpern charakterisiert werden. Ein kompetitiver Assay aus Toxin und Antikörper, der direkt an der Realprobe appliziert wurde, brachte den Zugang zu Kalibiergeraden, mit denen es möglich war, den Toxingehalt der Milch direkt zu bestimmen. Weitere Optimierung und
Untersuchung des Systems erscheint noch nötig. Bis zum jetzigen Zeitpunkt konnte noch nicht geklärt werden, wie sich veränderte Monoschichten auf Immobilisierung und unspezifische Bindungen auswirken. Beispiel dafür wäre eine Erniedrigung des Anteils der Carboxylgruppen und Ersatz derselben durch Hydroxidgruppen.
Die Kreuzreaktionen verschiedener Antikörper-Toxin-Paare wurden bereits auf dem Array untersucht und im Falle eines sekundären Systems für niedrig befunden. Diese Spezifikation müsste noch auf das SPR-System übertragen werden, um in Zukunft mehrere Toxine parallel auf einem Chip vermessen zu können. Großer Optimierungsbedarf besteht jedoch hinsichtlich des Zeitfaktors. Die komplette Toxinuntersuchung einer Milchprobe benötigt derzeit bei vollständig vorbereiteter und kalibrierter Messzelle 50 Minuten inklusive aller Wasch-schritte. Im Vergleich zu konventionellen Methoden wie der ELISA kann zwar erheblich Zeit eingespart werden, jedoch ist mit HPLC ein ähnlich schnelles oder schnelleres Ergebnis zu erwarten. Ansatzpunkt böte der Versuch, die Anfangssteigung der Kinetikkurven mit den Konzentrationen zu koppeln. Die Auswertung der bisherigen Ergebnisse lässt eine einfache Abhängigkeit vermuten, welche die Messzeit erheblich reduzieren würde. Kostenoptimierung kann zusätzlich vorgenommen werden. Derzeit werden alle Immobilisierungen mit einer Massenkonzentration von 50 mg/L vorgenommen. Diese könnte möglicherweise ohne erhebliche Reaktionszeitverlängerung verringert werden.
Zusammenfassend ist zu sagen, dass im Zuge dieser Arbeit wichtige Grundsteine für die neu konstruierte spezifische SPR-Sensorplattform der Enterotoxine gelegt wurden, jedoch noch eine Vielzahl an Optimierungs- und Variationsmöglich-keiten vorhanden ist. Bemerkenswert ist die Vielseitigkeit und Nachweisstärke der SPR-Spektroskopie, die durchaus mit den etablierten Methoden der Analytik und Sensorik in Konkurrenz treten kann.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 07:59
Nur für Besitzer und Autoren: Kontrollseite des Eintrags
Downloadstatistik