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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-204336
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 13 January 2012 |
| Referee: | Prof. Dr. Hans-Achim Wagenknecht and Prof. Dr. Burkhard König |
| Date of exam: | 28 March 2011 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Organische Chemie > Alumni or Retired Professors > Arbeitskreis Prof. Dr. Hans-Achim Wagenknecht |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 20433 |
Abstract (German)
Die Dissertation untergliedert sich in drei Hauptkapitel. Im ersten Kapitel wurde ein über zwei Stufen synthetisierter Perylenbisimidbaustein (PBI) mithilfe eines azyklischen Linkermoleküls als Phosphoramidit und automatisierter DNA-Festphasensynthese erfolgreich in zahlreiche Oligonukleotidstränge eingeführt. Als Grundlage für alle nachfolgenden Experimente wurden DNA-Sequenzen synthetisiert, ...
Abstract (German)
Die Dissertation untergliedert sich in drei Hauptkapitel.
Im ersten Kapitel wurde ein über zwei Stufen synthetisierter Perylenbisimidbaustein (PBI) mithilfe eines azyklischen Linkermoleküls als Phosphoramidit und automatisierter DNA-Festphasensynthese erfolgreich in zahlreiche Oligonukleotidstränge eingeführt.
Als Grundlage für alle nachfolgenden Experimente wurden DNA-Sequenzen synthetisiert, mit denen das Oxidationspotential des Chromophors gegenüber Guanin in Abhängigkeit des Abstands genauer betrachtet wurde. Es konnte festgestellt werden, dass mit zunehmender Distanz zwischen dem PBI und einem Guanin die Lochtransferrate stark abnimmt, bis ab einem Abstand von vier Zwischenbasen kein Ladungstransfer mehr stattfindet. In weiteren Experimenten wurde versucht, das im Doppelstrang existierende Aggregationsverhalten von PBI zur Detektion von Punktmutationen auszunutzen. Hierzu entstanden unterschiedlich kurze Oligonukleotide mit jeweils einem Chromophor am 3’- und 5’-Ende des Stranges. Durch Ausbildung der voll gepaarten Doppelhelix sollten die Chromophore aggregieren und die typische Dimeremission aufweisen. Es zeigte sich jedoch, dass sich sowohl im Einzel- als auch im potentiellen Doppelstrang excitonische Wechselwirkungen ausbildeten. Zusätzlich wurde die Einsatzmöglichkeit von Perylenbisimid in Molecular Beacons geprüft. Durch Einbau des Chromophors als diagonales Basenpaar in die Stammregion, die Elektronentransferprozesse aufgrund der gewählten Sequenz ausschließt, sollten die charakteristischen optischen Eigenschaften von PBI helfen, Gegenstränge nachzuweisen. Hierzu wurden zahlreiche Molecular-Beacon-Sonden mit unterschiedlichen Stamm- und Schleifenregionen untersucht. Es zeigte sich, dass es durch dieses Chromophor-Motiv möglich ist, Oligonukleotide sensitiv zu detektieren, auch wenn diese Basenfehlpaarungen zur Schleifenregion aufweisen. Durch eine zusätzliche Evaluation der Stammlänge wurde die Hybridisierungskinetik gezielt gesteigert. Der positive Einfluss von Ethanol auf die Hybridisierungsrate wurde zuletzt noch an trägen Molecular-Beacon-Systemen untersucht.
Im zweiten Kapitel wurden die Redoxeigenschaften des bereits beschriebenen Perylenbisimidbausteins durch eine Modifikation des aromatischen Systems mit elektronenschiebenden Pyrrolidinsubstituenten an den Positionen 1 und 7 der Buchtregion verändert. Hierdurch sollten Ladungstransferprozesse zwischen dem Chromophor und den Basen eines Oligonukleotids verhindert werden.
Der neue Chromophor (APBI) konnte in einer dreistufigen Synthese dargestellt werden. CV-Messungen belegten, dass durch den elektronenschiebenden Charakter der beiden Heterozyklen der photoangeregte APBI-Baustein nicht mehr in der Lage ist, die natürlichen Basen zu oxidieren oder zu reduzieren.
Der neu synthetisierte, zweifach pyrrolidinsubstituierte Perylenbisimidbaustein wurde über ein azyklisches Linkermolekül als Phosphoramidit mittels automatisierter DNA-Festphasensynthese in Oligonukleotidstränge eingebaut.
Das veränderte Redoxverhalten konnte ebenfalls in Oligonukleotiden bestätigt werden. Es zeigte sich zusätzlich eine Abhängigkeit des Fluoreszenzverhaltens eines modifizierten Oligonukleotides vom Hybridisierungszustand. Mittels einer selbstkomplementären APBI-modifizierten Sequenz, bei welcher die Chromophore ein künstliches diagonales Basenpaar bilden, wurde die Wechselwirkung zwischen den Farbstoffen untersucht. Die vollständige optische Charakterisierung des Doppelstranges zeigte deutlich, dass es sich bei den gebildeten Dimeren um H-Aggregate handelt.
Um den Effekt einer vollständigen Protonierung bzw. Deprotonierung des Farbstoffes zu untersuchen, wurden Oligonukleotide in Puffersystemen mit pH 3, pH 7 und 13 gemessen. Es konnte belegt werden, dass der Protonierungsgrad der N-Aminosubstituenten einen deutlichen Einfluss auf die elektrochemischen und optischen Eigenschaften des APBI besitzt.
Im letzten Kapitel wurde Perylenbisimid erfolgreich am 5’-Ende von drei Oligonukleotidsträngen über die automatisierte DNA-Festphasensynthese eingeführt. Die so entstandenen DNA-Sequenzen waren zueinander teilkomplementär und bildeten über die Watson-Crick-Basenpaarungen eine ypsilonartige Struktur aus. Aufgrund ihrer stark hydrophoben Eigenschaft und des großen konjugierten π-Systems bilden Perylenbisimidmoleküle untereinander starke π-π-Wechselwirkungen aus. Hierdurch formen sich größere, übergeordnete Netzwerkstrukturen. Dies konnte durch Messungen wie UV/Vis-Absorptionsspektroskopie, Emissionsspektroskopie, CD-Spektroskopie und AFM Messungen belegt werden. Als Kontrollexperimente und zur Bildung weniger verzweigter Strukturen wurden unmodifizierte Oligonukleotide mit identischer Sequenz synthetisiert. Auch diese neuen Monomerbausteine aggregieren und formen entsprechende Netzwerke. Durch eine starke Erhöhung der DNA-Konzentration fallen die gebildeten Aggregate aus und konnten so optisch sichtbar gemacht werden. Perylenbisimid ist somit als schwach fluoreszierender „Klebstoff“ für DNA und folglich zur Ausbildung größerer Netzwerkstrukturen geeignet.
Translation of the abstract (English)
Perylenebisimide (PBI) was incorporated synthetically into oligonucleotides using the automated DNA building block chemistry. The 2’-deoxyribofuranoside of natural nucleosides was replaced by (S)-aminopropan-2-3-diol as an acyclic linker between the phosphodiester bridges that is tethered to one of the imide nitrogens of the PBI dye. First, as a basis for further experiments the charge transfer ...
Translation of the abstract (English)
Perylenebisimide (PBI) was incorporated synthetically into oligonucleotides using the automated DNA building block chemistry. The 2’-deoxyribofuranoside of natural nucleosides was replaced by (S)-aminopropan-2-3-diol as an acyclic linker between the phosphodiester bridges that is tethered to one of the imide nitrogens of the PBI dye. First, as a basis for further experiments the charge transfer properties between PBI and guanin in dependence to the distance were elucidated. Corresponding to these results we designed molecular beacons bearing a hydrophobically interacting diagonal PBI base pair in the stem region. In the closed hairpin both chromophores are forced to act excitonically by the surrounding DNA framework yielding significant dimer absorption accompanied by an excimer-type fluorescence. Upon addition of complementary oligonucleotides the hairpin opens, the dyes get separated and the characteristical PBI absorption and emission is restored. That means that two different readouts are created simultaneously. By the addition of ethanol to the sample the kinetics of the hairpin opening could be accelerated.
For a broader field of application we designed perylene-1,7-dipyrrolidinyl-3,4:9,10-tetracarboxylicacid bisimide (APBI) as an artificial DNA substitution which should not be able to oxidize or reduce one of the natural DNA bases. The new compound was synthesized and incorporated synthetically into oligonucleotides using the automated DNA building block chemistry. The 2’-deoxyribofuranoside of natural nucleosides was again replaced by (S)-aminopropan-2-3-diol linker. The syntheses as well as spectroscopic and electrochemical properties of the DNA building block and the modified DNA strands are presented. To check the influence of the pH-value we additionally performed all experiments at pH 3, 7 and 13.
Finally the design and elucidation of a triangular DNA that aggregates spontaneously by the stacking interactions between PBI caps yielding characteristic optical readout were presented. We prepared three oligonucleotides that bear a PBI chromophore at the 5’-terminal position and possess two separate regions which are complementary to one region in each of the other two oligonucleotides. It is known that the 5’-terminally attached PBI dye is able to induce dimerization of whole DNA duplexes which can be followed by UV/Vis absorption, fluorescence, circular dichroism spectroscopy and AFM. Accordingly, we studied the aggregation of this Y-shaped DNA construct by these methods of optical spectroscopy. Additionally the UV/Vis absorption, steady-state fluorescence and CD spectra of the full construct bearing three PBI caps was compared with triple strands with only two, one or without any PBI caps.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 15:21
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