Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht, die A1AO ATP-Synthase von I. hospitalis zu reinigen und die Untereinheitenzusammensetzung des Komplexes zu bestimmen. Obwohl der gekoppelte Komplex erfolgreich durch das Detergenz DDM (n-Dodecyl-β-D-Maltopyranosid) aus der Membran herausgelöst werden konnte, war eine Reinigung des Gesamtkomplexes bisher nicht möglich. Zahlreiche Versuche, das Enzym über ...
Abstract (German)
Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht, die A1AO ATP-Synthase von I. hospitalis zu reinigen und die Untereinheitenzusammensetzung des Komplexes zu bestimmen. Obwohl der gekoppelte Komplex erfolgreich durch das Detergenz DDM (n-Dodecyl-β-D-Maltopyranosid) aus der Membran herausgelöst werden konnte, war eine Reinigung des Gesamtkomplexes bisher nicht möglich. Zahlreiche Versuche, das Enzym über säulenchromatographische Verfahren zu reinigen, führten lediglich zu einer Anreicherung der dissoziierten A1- und AO-Subkomplexe der ATP-Synthase. Eine Identifizierung der Untereinheiten war durch eine Kombination von 2D-Native/SDS-PAGE, Western-Blot-Analysen und MALDI-TOF MS/MS möglich. So konnte die in vivo Expression von acht annotierten Untereinheiten der ATP-Synthase (A, B, C, D, E, F, a(I) und c(K)) bestätigt und das Protein Igni1215 als Bestandteil der ATP-Synthase (Untereinheit H) identifiziert werden. Die beiden erhaltenen Subkomplexe bestanden aus A, B, E und F (A1) und aus C, D, H und a (AO). Die Untereinheit c war nur unregelmäßig als Bestandteil des AO-Subkomplexes nachzuweisen. Der A1-Subkomplex wurde erfolgreich über zwei Chromatographien gereinigt. Durch LILBID-MS wurde die molekulare Masse des A1-Subkomplexes auf 390 kDa und die Stöchiometrie zu A3B3EF bestimmt. Erste Kristallisationsversuche mit dem gereinigten A1-Komplex führten bereits zu einem Kristall, der eine Röntgenbeugung mit Reflexen von bis zu 2,8 Å erreichte. Allerdings war der Kristall zu klein, um einen vollständigen Datensatz für eine erfolgreiche Strukturaufklärung zu sammeln. Die ATP-Synthesefähigkeit der A1AO ATP-Synthase wurde durch sogenannte ‚pH-Jump‘ Experimente an frischen, intakten I. hospitalis-Zellen bewiesen. Hierbei konnte die ATP-Synthese durch den künstlich angelegten Protonengradienten signifikant stimuliert und durch die Behandlung mit den Inhibitoren DES, DCCD, TBT sowie dem Protonophor TCS inhibiert werden. Das Fehlen eines Na+-Bindemotivs in der c-Untereinheit deutet darauf hin, dass I. hospitalis Protonen als Kopplungsionen verwendet. Die subzelluläre Lage der A1AO ATP-Synthase wurde nach Immunmarkierung von ganzen I. hospitalis-Zellen und an Ultradünnschnitten durch fluoreszenz- und elektronenmikroskopische Untersuchungen geklärt. Überraschenderweise zeigten die Immunmarkierungsversuche, dass die ATP-Synthase nicht in der inneren, sondern in der äußeren Membran von I. hospitalis lokalisiert ist. In gleicher Weise wurde auch die H2:Schwefel-Oxidoreduktase in der äußeren Membran lokalisiert, was zu dem Schluss einer energetisierten äußeren Membran von I. hospitalis und einer ATP-Synthese im Intermembran-Kompartiment führte. Im Gegensatz dazu wurden DNA, RNA und Ribosomen im Cytoplasma lokalisiert. Folglich findet die Energiekonservierung in I. hospitalis räumlich getrennt von der Informationsprozessierung statt. Damit wurde für I. hospitalis eine funktionelle Kompartimentierung nachgewiesen, die derart für einen Prokaryonten noch nicht beschrieben wurde.
Translation of the abstract (English)
In this work we tried to purify the A1AO ATP-synthase of I. hospitalis to determine its subunit composition. Despite the coupled A1AO ATP-synthase was solubilized successfully by the detergent DDM (n-dodecyl-β-D-maltopyranoside), a purification of the intact holoenzyme was not achieved. Numerous attempts to purify the enzyme by column based chromatographic procedures only led to an enrichment of ...
Translation of the abstract (English)
In this work we tried to purify the A1AO ATP-synthase of I. hospitalis to determine its subunit composition. Despite the coupled A1AO ATP-synthase was solubilized successfully by the detergent DDM (n-dodecyl-β-D-maltopyranoside), a purification of the intact holoenzyme was not achieved. Numerous attempts to purify the enzyme by column based chromatographic procedures only led to an enrichment of the dissociated A1- and AO-subcomplexes of the ATP-synthase. The subunit composition of the in vivo expressed ATP-synthase subunits was determined by a combination of 2D-native/SDS-PAGE-, western-blot- and MALDI-TOF MS/MS analyses and reveled the subunits A, B, C, D, E, F, a and c as being part of the complex. Furthermore the protein Igni1215 was identified as subunit H. The enriched A1- and AO-subcomplexes consisted of A, B, E and F (A1) as well as C, D, H, and a (AO). Subunit c was only purified intermittently as part of the AO-subcomplex. The molecular mass of the A1-subcomplex was determined 390 kDa by LILBID-analyses and the stochiometry as A3B3EF. First attempts to crystallize the purified A1-subcomplex led to a crystal with a diffraction pattern of about 2.8 Å, but the crystals were not big enough to solve the structure of the complex. The ability of the ATP-synthase to synthesize ATP was proven by so called pH-jump experiments with whole and intact I. hospitalis cells. Here the artificial proton gradient was able to stimulate ATP-synthesis significant. This ATP-synthesis was inhibited by DES, DCCD, TBT and the protonophor TCS. The subcellular localization of the A1AO ATP-synthase was determined by fluorescence- and electronmicroscopic analyses of immunolabeled ultrathin sections and cells of I. hospitalis. Surprisingly the enzyme was not localized in the inner membrane but in the outer membrane. The same result was obtained for the immunolocalization of the H2:sulfur-oxidoreductase. This enzyme complex is also exclusively located in the outer membrane leading to the conclusion that the outer membrane of I. hospitalis is energized and ATP synthesis does not happen in the cytoplasm, but in the intermembrane compartiment of I. hospitalis. In contrast DNA, RNA and ribosomes were only localized in the cytoplasm indicating a spatial separation of information processing and energy conserving processes in I. hospitalis.
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