| License: Publishing license for publications excluding print on demand (7MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-209482
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.20948
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 22 May 2012 |
| Referee: | Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer and Prof. Dr. Ulrich Bogdahn |
| Date of exam: | 18 May 2011 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Neurologie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Keywords: | NMR-Spektroskopie, Zelluläre MRS, Magnetische Suszeptibilität, neurale Vorläuferzellen, Tumorstammzellen, Neurogenese, Tumorigenese, Klonogenität, Makrophagen, Lipoproteine |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 20948 |
Abstract (English)
NMR spectroscopy of living organisms provides a non-invasive and comprehensive insight into cellular composition and metabolism. In addition, identifying cell-specific NMR spectroscopic signals and patterns may lead to in vivo detection and tracking of different cell types including stem cells and tumor-initiating cells. In this dissertation, the methodology of in vitro high-resolution 1H-NMR ...
Abstract (English)
NMR spectroscopy of living organisms provides a non-invasive and comprehensive insight into cellular composition and metabolism. In addition, identifying cell-specific NMR spectroscopic signals and patterns may lead to in vivo detection and tracking of different cell types including stem cells and tumor-initiating cells.
In this dissertation, the methodology of in vitro high-resolution 1H-NMR spectroscopy on cell suspensions of brain-derived stem cells was investigated. Different sample preparations of cell suspensions, i.e. agarose embedding, sedimentation and pelleting, were compared regarding reproducible interpretation of NMR spectra. A possible explanation for cell density-dependent line broadenings, namely inhomogeneous magnetic B-field distributions, was supported by numerical simulations of B-field distortions in consequence of differences in magnetic susceptibility between intracellular and extracellular compartments. Methods were analyzed that allowed discrimination between different subtypes of NMR-visible molecules within cell suspensions. It could be shown that highly-resolved resonances almost exclusively originated from extracellular molecules. In case of metabolites and amino acids, a further pool of molecules with reduced self-diffusion was identified that gave rise to line broadened resonances. Regarding NMR-visible macromolecules, different relaxation- and diffusion-parameters were exploited to disentangle contributions from mobile lipids and mobile proteins. With respect to temperature, a reasonable long-term stability could be shown in NMR spectra acquired at 5° C, whereas at 37° C a stopped metabolism followed by continuous proteolysis was observed.
Moreover, the biological relevance of NMR-visible mobile lipids was investigated in terms of cellular stress and regarding stem cell-specificity. In cultured neural progenitor cells (NPC) and glioblastoma-derived tumor-initiating cells (BTIC) a positive correlation of mobile lipids to cell death was revealed. A further promoting factor for mobile lipid appearance and increase, i.e. cell culture confluence, could be identified not only in brain-derived stem cells, i.e. NPC and BTIC, but also for several control cell lines, e.g. mesenchymal stem cells (MSC), COS7 fibroblasts, and in one out of three differentiated glioblastoma tumor cell lines (GBM TC “HTZ-417”). In contrast, a connection between mobile lipids and biological surrogate markers for stem cell identity, e.g. clonogenicity, could not be observed. However, cell type- and cell line-specific responses of confluence-induced mobile lipids to treatment with transforming growth factor β (TGF-β) were evident.
Adressing the NMR-visibility of cellular lipids, native low-density lipoproteins (LDL) and enzymatically degraded LDL (E-LDL) served as defined models for lipid droplets and lipid membranes, respectively. In contrast to native LDL, multilamellar E-LDL did not exhibit lipid resonances in NMR spectra, thus promoting the hypothesis of invisible lipid membranes. On the contrary, NMR spectroscopy of macrophages loaded with E-LDL revealed a transformation of the incorporated lipids to an at least partially NMR-visible structure. Furthermore, an increase in polyunsaturation of NMR-visible lipids was evident upon E-LDL-loading.
A small cohort of BTIC-lines was analyzed by statistical analyses to unveil possible connections between biological surrogate markers for stem cell identity and NMR-spectroscopic features. Regarding clonogenicity, a significant positive correlation to a specific NMR-spectral region including resonances of glutamate, mobile lipids and mobile proteins (2.28 ppm – 2.38 ppm) was calculated. Principal component analysis revealed a relative similarity of NMR spectra within each BTIC-line and a moderate clustering according to low or high clonogenicity.
Translation of the abstract (German)
Die NMR-Spektroskopie an lebenden Organismen bietet einen nichtinvasiven und umfassenden Einblick in die Zusammensetzung und den Stoffwechsel auf zellulärer Ebene. Zusätzlich könnte die Identifizierung von zellspezifischen NMR-spektroskopischen Signalen und Signalmustern die Detektion und Verfolgung von unterschiedlichen Zelltypen inklusive Stammzellen und tumorinitiierenden Zellen in vivo ...
Translation of the abstract (German)
Die NMR-Spektroskopie an lebenden Organismen bietet einen nichtinvasiven und umfassenden Einblick in die Zusammensetzung und den Stoffwechsel auf zellulärer Ebene. Zusätzlich könnte die Identifizierung von zellspezifischen NMR-spektroskopischen Signalen und Signalmustern die Detektion und Verfolgung von unterschiedlichen Zelltypen inklusive Stammzellen und tumorinitiierenden Zellen in vivo ermöglichen.
Innerhalb dieser Dissertation wurde die Methodik der hochaufgelösten in vitro 1H-NMR-Spektroskopie an Zellsuspensionen von Gehirn-assozierten Stammzellen untersucht. Es wurden unterschiedliche Probenpräparationsmethoden bezüglich einer reproduzierbaren Interpretation der NMR-Spektren verglichen, insbesondere das Einbetten der Zellen in Agarose bzw. die Bildung eines Zellpelletts durch Sedimentation. Eine mögliche Erklärung für Zelldichte-abhängige Linienverbreiterungen, nämlich inhomogene Magnetfeld-Verteilungen, wurde unterstützt durch numerische Simulationen der magnetischen B Feldverzerrungen als Folge unterschiedlicher magnetischer Suszeptibilitäten zwischen intrazellulären und extrazellulären Kompartimenten. Methoden wurden analysiert, die eine Unterscheidung von NMR-sichtbaren Molekül-Subgruppen innerhalb der Zellsuspensionen ermöglichten. Es konnte gezeigt werden, dass hochaufgelöste Resonanzen ihren Ursprung fast ausschließlich in extrazellulären Molekülen hatten. In Bezug auf NMR-sichtbare Makromoleküle wurden unterschiedliche Relaxations- und Diffusionsparameter ausgenutzt, um Anteile mobiler Lipide von denen mobiler Proteine zu separieren. Hinsichtlich der Temperatur konnte eine vertretbare Langzeitstabilität in NMR-Spektren, die bei 5° C aufgenommen wurden, festgestellt werden, wohingegen bei 37° C Anzeichen von metabolischem Stillstand und kontinuierlichem Proteinabbau beobachtet werden konnten.
Darüber hinaus wurde die biologische Relevanz der NMR-sichtbaren mobilen Lipide in Bezug auf zellulären Stress und auf Stammzellspezifität untersucht. In kultivierten neuralen Vorläuferzellen (NPC) und Glioblastom-assoziierten tumorinitiierenden Zellen (BTIC) wurde eine positive Korrelation zwischen den mobilen Lipiden und Zelltod aufgedeckt. Es konnte ein weiterer begünstigender Faktor für das Auftreten und die Zunahme von mobilen Lipiden identifiziert werden, nämlich Zellkulturkonfluenz, nicht nur in Gehirn-assoziierten Stammzellen, d.h. NPC und BTIC, sondern auch in mehreren Kontrollzelllinien, z.B. mesenchymalen Stammzellen (MSC), COS7-Fibroblasten und in einer der drei untersuchten differenzierten Glioblastom-Tumorzelllinien (GBM TC „HTZ-417“). Im Gegensatz dazu konnte ein Zusammenhang zwischen mobilen Lipiden und biologischen Surrogatmarkern für Stammzellidentität, z.B. Klonogenität, nicht beobachtet werden. Jedoch zeigten sich zelltyp- und zelllinienspezifische Reaktionen auf Behandlung mit transformierenden Wachstumsfaktoren (TGF-β) in den mobilen Lipidsignalen.
Zur Untersuchung der NMR-Sichtbarkeit von zellulären Lipiden dienten native Lipoproteine (LDL) als Modellstrukturen für Lipidtröpfchen und entsprechend enzymatisch degradierte Lipoproteine (E-LDL) als Modelle für Membranstrukturen. Im Gegensatz zu nativem LDL zeigten die multilamellaren E-LDL keine Lipidresonanzen in den NMR-Spektren, was die These bekräftigte, dass Lipidmembranen NMR-unsichtbar sind. Auf der anderen Seite deckte die NMR-Spektroskopie von E-LDL-beladenen Makrophagen auf, dass die aufgenommenen Lipide zumindest teilweise in NMR-sichtbare Strukturen umgewandelt wurden. Zusätzlich konnte ein Anstieg im Grad der Mehrfachsättigung der NMR-sichtbaren Lipide infolge der E-LDL-Beladung beobachtet werden.
Im Rahmen einer kleinen Studie an BTIC-Linien wurden statistische Methoden angewendet, um mögliche Zusammenhänge zwischen biologischen Surrogatmarkern für Stammzellidentität und NMR-spektroskopischen Merkmalen aufzudecken. Im Bezug auf Klonogenität wurde eine signifikante positive Korrelation zu einer bestimmten NMR-spektralen Region (2.28 ppm – 2.38 ppm) berechnet, die Resonanzen von Glutamat, mobilen Lipiden und mobilen Proteinen beinhaltet. Hauptkomponentenanalysen ergaben eine relative Ähnlichkeit in NMR-Spektren von Proben derselben BTIC-Linie, und deckten ein mittelmäßiges Clustern in Bezug auf hohe und niedrige Klonogenität auf.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 06:44
Owner only: item control page
Download Statistics