| License: Publishing license for publications excluding print on demand (11MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-215813
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.21581
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 11 January 2012 |
| Referee: | Prof. Dr. Thomas Langmann and PD. Dr. Wulf Schneider |
| Date of exam: | 7 July 2011 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Immunologie |
| Keywords: | TNFR1, tumor necrosis factor receptor-1, adenovirus, E3-14.7K, apoptosis |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 21581 |
Abstract (German)
TNF ist ein pleiotropes Zytokin, dessen vielfältige biologische Funktionen hauptsächlich über den TNFR1 vermittelt werden. Dieser wird aufgrund seiner konstitutiven Verbreitung auf nahezu allen Zelltypen und Geweben als Hauptmediator des TNF-Signals angesehen. Über ihn können drei Signalkaskaden in der Zelle aktiviert werden: 1) Apoptose, 2) NFkB-Signalweg und 3) MAPK-Signalwege. Während die ...
Abstract (German)
TNF ist ein pleiotropes Zytokin, dessen vielfältige biologische Funktionen hauptsächlich über den TNFR1 vermittelt werden. Dieser wird aufgrund seiner konstitutiven Verbreitung auf nahezu allen Zelltypen und Geweben als Hauptmediator des TNF-Signals angesehen. Über ihn können drei Signalkaskaden in der Zelle aktiviert werden: 1) Apoptose, 2) NFkB-Signalweg und 3) MAPK-Signalwege. Während die Aktivierung von NF(kappa)B und der MAPK-Signalkaskaden von der Internalisierung des Rezeptors unabhängig ist, ist diese für die Einleitung der Apoptose essentiell (Schütze et al. 1999). Dabei werden die Adapterproteine TRADD, FADD und Caspase-8, die zusammen den DISC (death inducing signaling complex) bilden, an die cytoplasmatische Todesdomäne des Rezeptors rekrutiert, was zur Aktivierung der Initiator-Caspase-8 und nachfolgender Effektor-Caspasen führt (Schneider et al. 2004). Durch die Expression des Adenovirus E3-14.7K Proteins (kurz 14.7K) können Zellen vor der TNF-induzierten Apoptose geschützt werden. Schneider et al. fanden heraus, dass in Anwesenheit von 14.7K sowohl die Internalisierung des Rezeptors als auch die Rekrutierung des DISC gehemmt ist (Schneider et al. 2006). 14.7K selbst konnte aber keine Interaktion mit dem TNFR1 nachgewiesen werden, weshalb die Möglichkeit in Betracht gezogen wurde, dass die anti-apoptotische Wirkung durch zelluläre Interaktionspartner vermittelt werden könnte. Durch einen yeast two hybrid screen wurden vier zelluläre Interaktionspartner von 14.7K identifiziert, darunter Optineurin (Horwitz 2004). Da Optineurin selbst TNF-induziert an den TNFR1 rekrutiert werden kann (Zhu et al. 2007) und über weitere Interaktionspartner in endo- und exocytotische Vesikeltransportprozesse involviert ist (Sahlender et al. 2005), schien es ein möglicher Kandidat zur Vermittlung der 14.7K-bedingten TNF-Resistenz zu sein. Optineurin ist zudem an der Regulation des Transkriptionsfaktors NFkB beteiligt, der unter anderem die Expression anti-apoptotischer Proteine in Gang setzt. Die Bedeutung der Interaktion von 14.7K mit Optineurin für die TNFR1-Signalkaskade wurde deshalb in der vorliegenden Arbeit untersucht.
Als Hilfsmittel zur Untersuchung 14.7K-assoziierter Prozesse wurde dazu zunächst ein polyklonaler Antikörper gegen 14.7K hergestellt, der das Protein sowohl in Western Blot, Immunpräzipitation und Immunfluoreszenz detektiert. Mit Hilfe eines Mammalian Two-Hybrid Assay und einer Co-Immunpräzipitation wurde die Interaktionsfähigkeit verschiedener 14.7K-Mutanten mit Optineurin untersucht. In einem nachfolgenden Zytotoxizitätsassay zur Überprüfung des Zusammenhangs zwischen der Interaktionsfähigkeit mit Optineurin und der protektiven Eigenschaft der 14.7K-Mutanten konnte keine Korrelation festgestellt werden. Zudem konnten auch Zellen, in denen die Expression von Optineurin durch siRNA unterdrückt wurde, durch 14.7K vor TNF-induzierter Apoptose geschützt werden. Nachdem in Optineurin-supprimierten Zellen außerdem durch einen TNFR1-Internalisierungsassay gezeigt werden konnte, dass die Blockade der TNFR1-Internalisierung durch 14.7K von der Expression von Optineurin unabhängig ist, schließen diese Ergebnisse insgesamt eine Beteiligung von Optineurin an der Ausprägung des anti-apoptotischen Effekts durch 14.7K aus. Um herauszufinden, ob die TNF-abhängige Rekrutierung von Optineurin an den TNFR1 durch die Expression von 14.7K beeinflusst wird, wurden magnetisch markierte TNFR1-Proteinkomplexe aus 14.7K-exprimierenden Zellen isoliert. Die Analyse dieser Proteinkomplexe ergab, dass Optineurin auch in Anwesenheit von 14.7K an den Rezeptor gelangt. Interessanterweise konnte dabei auch 14.7K selbst in Assoziation mit dem TNFR1-Komplex detektiert werden, wobei Optineurin als Adapterprotein in Frage kommen könnte. Da sowohl die Aktivierung von NFkB und die der MAPK-Signalkaskaden p38, JNK und Erk über den TNFR1 vermittelt werden können und Optineurin regulatorisch in die Aktivierung von NFkB involviert ist, wurde überprüft, ob diese durch die Expression von 14.7K beeinträchtigt wird. Beide Signalwege zeigten jedoch in ihrer Signaltransduktion keine Veränderung durch die Anwesenheit von 14.7K.
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass der 14.7K-vermittelte Schutz vor TNF-induzierter Apoptose von der Interaktion mit Optineurin unabhängig ist. Weiterhin stellte sich heraus, dass 14.7K an den TNFR1-Proteinkomplex rekrutiert wird, wobei Optineurin als Adapterprotein dienen könnte. Die Aktivierung von NFkB und der MAP-Kinasen p38, JNK und Erk wird durch die Expression von 14.7K nicht beeinflusst.
Translation of the abstract (English)
Tumor necrosis factor alpha (TNFa) is a pleiotropic cytokine with several biological functions mainly mediated by TNF-receptor 1 (TNFR1). This particular receptor is ubiquitously expressed on various cell types which makes it to the key mediator of TNF-signaling. After ligand binding, TNFR1 induces three signaling cascades of diverse functions: 1) the apoptosis signaling pathway, 2) the ...
Translation of the abstract (English)
Tumor necrosis factor alpha (TNFa) is a pleiotropic cytokine with several biological functions mainly mediated by TNF-receptor 1 (TNFR1). This particular receptor is ubiquitously expressed on various cell types which makes it to the key mediator of TNF-signaling. After ligand binding, TNFR1 induces three signaling cascades of diverse functions: 1) the apoptosis signaling pathway, 2) the anti-apoptotic NFkB signaling pathway and 3) the MAPK signaling cascade. Internalization of TNFR1 is the prerequisite event for the induction of the apoptotic signaling pathway, whereas NFkB or MAPK activation seems to be independent of the receptor-internalization process (Schütze et al. 1999). Upon TNF-treatment apoptotic signaling starts with the recruitment of the death inducing signaling complex (DISC) to the activated death domain of internalized TNFR1 (Schneider et al. 2004). This particular complex comprises the adapter proteins TRADD, FADD and caspase-8, initiates caspase-8 activation and finally leads into the activation of downstream effector caspases in order to begin the processes of apoptosis. Cells can be protected from TNF-mediated apoptosis by the expression of a small adenoviral protein, named E3-14.7K (14.7K). The protein 14.7K was shown to specifically block TNFR1-internalization and also the recruitment of the DISC proteins to the receptor´s death domain (Schneider et al. 2006). To date, a direct interaction of 14.7K and TNFR1 has not been detected, therefore 14.7K was considered to mediate this anti-apoptotic effect via other intracellular proteins. With the use of a yeast two hybrid screen, Horwitz and coworker could identify the protein optineurin as one of four 14.7K interacting proteins (Horwitz 2004). Furthermore, recent publications revealed that optineurin is recruited to the TNFR1-protein complex upon TNF stimulation (Zhu et al 2007). Optineurin was also found to be involved in endo- and exocytotic vesicle trafficking via other interaction partners (Sahlender et al 2005). Optineurin was also linked to transcription factor NFkB activation, which promotes the expression of anti-apoptotic proteins. Therefore, optineurin was thought to be a potential candidate to mediate the observed TNF-resistance of 14.7K expressing cells. The molecular changes in TNFR1 signaling resulting from this interaction of 14.7K with optineurin was analyzed in this present study.
With the aim of detecting 14.7K protein in Western Blot and localizing this protein in cells via immunofluorescence staining, a polyclonal antibody was produced. This antibody was also used for immunoprecipitation assays. In order to investigate the interaction of optineurin with different 14.7K mutants, a mammalian two-hybrid assay was used and observed interaction was confirmed by co-immunprecipitation. A subsequent performed cytotoxicity assay revealed that TNF-resistance is independent of optineurin-interaction with 14.7K. These data correlate with results from experiments, where optineurin expression was suppressed by specific siRNA and here 14.7K still was able to protect cells from TNF mediated apoptosis. Furthermore, monitoring the blockade of TNF-induced TNFR1-internalization by 14.7K, the absence of optineurin had no influence.
Collectively, these results exclude a contribution of optineurin to the anti-apoptotic effect mediated by 14.7K. In order to investigate whether expression of 14.7K may affect the TNF-induced recruitment of optineurin to activated TNFR1, magnetic labeled TNFR1 protein complexes were isolated and analyzed by Western Blot. Expression of 14.7K did not influence the recruitment of optineurin to the activated TNFR1 complex. Interestingly, 14.7K seemed to be a component of the TNFR1 protein complex according to the data of the present work. Therefore it is conceivable that optineurin might act as an adaptor molecule for binding 14.7K to the receptor. As TNFR1 mediates the activation of MAPKs (p38, JNK, Erk) and NFkB upon TNF stimulation and optineurin functions as a regulator of NFkB activation, it was considered that 14.7K may influence these pathways also. However, neither activation of NFkB nor the MAPK signal cascades were affected by the presence of 14.7K.
In summary, this study showed that interaction of 14.7K with optineurin is dispensable for mediating TNF-resistance. Strikingly, a specific recruitment of 14.7K to the TNFR1 protein complex was demonstrated for the first time. Optineurin might serve as an adaptor protein for binding 14.7K to the receptor. The activation of the transcription factor NFkB and MAPK p38, JNK and Erk, however, seemed to be unaffected by 14.7K.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 06:19
Owner only: item control page
Download Statistics