| License: Publishing license for publications excluding print on demand (20MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-216852
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.21685
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 16 August 2012 |
| Referee: | Prof. Dr. Jens Schlossmann and Prof. Dr. Frank Schweda |
| Date of exam: | 2 August 2011 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmacology and Toxicology (Prof. Schlossmann, formerly Prof. Seifert) |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | IRAG, SOCE, cGK, IP3R, VSMC, cGMP, NO, ANP |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 21685 |
Abstract (German)
Die NO/cGMP/cGK-Signalkaskade ist von zentraler Bedeutung für den myogenen Tonus glattmuskulärer Organe. Ihre gefäßrelaxierende Wirkung beruht hierbei zu großen Teilen auf der Senkung der freien intrazellulären Calciumkonzentration. Diese wird vor allem durch die Modulation und Interaktionen der Substrate der cGKinase vermittelt. Das IP3R1-assoziierte cGKinase-Substrat (IRAG) ist hierbei ein ...
Abstract (German)
Die NO/cGMP/cGK-Signalkaskade ist von zentraler Bedeutung für den myogenen Tonus glattmuskulärer Organe. Ihre gefäßrelaxierende Wirkung beruht hierbei zu großen Teilen auf der Senkung der freien intrazellulären Calciumkonzentration. Diese wird vor allem durch die Modulation und Interaktionen der Substrate der cGKinase vermittelt.
Das IP3R1-assoziierte cGKinase-Substrat (IRAG) ist hierbei ein stabil in der Membran des Sarkoplasmatischen Retikulums verankertes Protein. Es bildet einen trimeren Komplex mit cGK1β und IP3R1. Durch die Deletion von Exon 12 im IRAG-codierenden Gen wurde in früheren Arbeiten eine Mauslinie generiert, deren verkürztes IRAG IP3R1 nicht mehr bindet. Anhand dieser Tiere konnte bereits ein Defekt in der Calciumregulation glattmuskulärer Organe gezeigt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde daher die Funktion von IRAG vor allem im Hinblick auf die Regulation der Calciumhomöostase im glatten Muskel untersucht. Diese Untersuchungen wurden an der kürzlich generierten IRAG-Knockout-Maus durchgeführt.
Bei der Analyse der Proteine des trimeren Komplexes in glattmuskulären Organen der IRGA-KO-Tiere war die Expression der cG-Kinasen deutlich verändert im Vergleich zu den Organen aus WT-Tieren. In allen untersuchten Organen war eine verminderte cGK1β Expression zu detektieren. Eine Hochregulation von cGK1α, wie bei den IRAG Δ12 Tieren beobachtet werden konnte, war mit Ausnahme des Magens nicht gegeben.
Die Expression der IP3Rezeptoren war wenig verändert. Lediglich im Magen war IP3R2 hochreguliert, im Jejunum war kein IP3R3 mehr zu detektieren. Hierdurch wäre eine Funktion von IRAG auch bei der Exkretion von Verdauungssekreten denkbar.
Bei Immunfärbungen wurde der trimere Komplex in VSMC nachgewiesen. IRAG zeigte starke Kolokalisation mit cGK1β und IP3R1, nicht aber mit cGK1α. In VSMC aus KO-Tieren war keine unterschiedliche Verteilung der Proteine zu erkennen. Auch bei Stimulation mit cGMP waren keine Unterschiede in der Lokalisation der Proteine in den KO oder WT VSMC zu erkennen. Dies betraf sowohl ihre absolute Lage innerhalb der Zelle, als auch ihre relative Lage zu anderen Zellorganellen. Eine Kerntranslokation der cG-Kinasen fand nicht statt.
Durch Experimente an VSMC von WT-Mäusen wurde in dieser Arbeit die 8 Br-cGMP-abhängige Inhibierung der Calciumfreisetzung gezeigt. Dieser Effekt war an die Anwesenheit von IRAG gebunden und war in VSMC aus IRAG-KO-Tieren nicht zu beobachten. Dies bestätigt die Ergebnisse aus früheren Versuchen mit IRAG Δ12 Tieren. Zudem wurde in der vorliegenden Arbeit die Bedeutung von IRAG auch für die verminderte Calciumfreisetzung durch die Generierung endogenen cGMPs gezeigt. Hiervon waren sowohl der Signalweg der löslichen Guanylatzyklase mit DEA NO als auch der partikulären Guanylatzyklase mit ANP betroffen.
Wie bei den VSMC aus Δ12 Tieren bereits beschrieben, war kein Effekt von IRAG auf den spannungsabhängigen Calciumeinstrom zu detektieren.
Weiterhin wurde eine Beteiligung von IRAG am SOCE gezeigt. Dieser war in VSMC von WT-Tieren in Gegenwart von 8 Br-cGMP stark vermindert. Diese Inhibition war von der Anwesenheit extrazellulären Natriums abhängig. In VSMC aus KO-Tieren war diese Inhibition nicht zu beobachten. Zudem zeigten die VSMC beim SOCE unterschiedliche Triebkraft für Kalium und Chloridionen. Unterschiede im Membranpotential waren hierbei nicht zu detektieren.
Innerhalb der verschiedenen Calciumsignalwege zeigen diese Befunde die Funktion von IRAG zur cGMP-abhängigen Senkung des Hormon-vermittelten Anstiegs der intrazellulären Calciumkonzentration. Calciumfreisetzung und SOCE hängen mechanistisch eng zusammen. Bei einer Entspeicherung des SR kommt es folglich immer zum SOCE. Die Wirkung von IRAG wäre hierbei synergistisch, sowohl zur Hemmung der Entspeicherung, wie auch zur Hemmung des Einstroms.
Translation of the abstract (English)
The NO/cGMP/cGK signaling cascade is essential for the tone of smooth musculature. The relaxing effect of this cascade is mainly a result of reduced intracellular calcium concentration, which is achieved by the modulation and interaction of substrates of the cGMP dependent kinase (cGK). The IP3R1 associated cGK substrate (IRAG) is a membrane bound protein of the sarcoplasmatic reticulum. It is ...
Translation of the abstract (English)
The NO/cGMP/cGK signaling cascade is essential for the tone of smooth musculature. The relaxing effect of this cascade is mainly a result of reduced intracellular calcium concentration, which is achieved by the modulation and interaction of substrates of the cGMP dependent kinase (cGK).
The IP3R1 associated cGK substrate (IRAG) is a membrane bound protein of the sarcoplasmatic reticulum. It is part of a trimeric complex with cGK1β and IP3R1. Deletion of exon 12 in a former mouse line (IRAGΔ12) resulted in a truncated IRAG protein, which was unable to bind IP3R1. In these animals an impaired calcium regulation of smooth musculature was observed.
Therefore the role of IRAG in the calcium homeostasis of smooth musculature was investigated in detail in the current work. The work was performed on the recently created IRAG knock out mouse (IRAG KO).
The analysis of the expression level of proteins of the trimeric complex by Western blot revealed a reduced expression of cGK1β in tissues of KO animals. An upregulation of cGK1α as described for the tissues of IRAGΔ12 animals was not observed with exception of stomach derived tissue.
The expression level of IP3R1 was unchanged. IP3R2 was upregulated in the stomach of RAG KO mice, IP3R3 could not be detected in the Jejunum of IRAG KO animals. These results imply a role of IRAG in the secretion of digestion enzymes.
The trimeric complex was shown by immunecytochemistry in vascular smooth muscle cells (VSMC). IP3R1 and cGK1β, but not cGK1α, co localized with IRAG. VSMC of IRAG KO mice showed no change in sub cellular distribution of these proteins, neither under control, nor under stimulating conditions with 8 Br-cGMP.
Hormone induced calcium liberation was inhibited in VSMC of WT mice by incubation with 8 Br-cGMP. This effect was bound to the presence of IRAG, and was not observed in VSMC of IRAG KO mice. This is in accordance to earlier results from VSMC of IRAGΔ12 animals. Furthermore the importance of IRAG for the augmentation of hormone induced calcium liberation was shown by the creation of endogenous cGMP by stimulation of the soluble Guanyly cyclase with DEA-NO and the particular Guanyly cyclase with ANP.
IRAG had no effect on voltage gated calcium entry, but showed a significant effect on store operated calcium entry (SOCE). SOCE was augmented in VSMC of WT mice in the presence of 8 Br-cGMP. This augmentation was dependent on extra cellular sodium and was not observed in VSMC of IRAG KO mice. Furthermore IRAG KO VSMC revealed impaired driving force for potassium and chloride ions. The membrane potential was not changed in comparison to WT VSMC.
These results imply a synergistic effect of IRAG on reduction of intracellular calcium concentration, by inhibiting calcium liberation from the sarcoplasmic reticulum and by inhibiting SOCE.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 06:16
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