Bei LMX1B handelt es sich um ein Mitglied der Familie der LIM-Homöodomäne-Transkriptionsfaktoren, die in Vertebraten eine fundamentale Rolle bei der Entwicklung und der Aufrechterhaltung der Funktion zahlreicher Gewebe spielen. Mutationen im LMX1B-Gen führen zum Auftreten des Nagel-Patella-Syndroms (NPS), einer seltenen autosomal dominant vererbten Erkrankung, die nach ihren hervorstechendsten ...
Abstract (German)
Bei LMX1B handelt es sich um ein Mitglied der Familie der LIM-Homöodomäne-Transkriptionsfaktoren, die in Vertebraten eine fundamentale Rolle bei der Entwicklung und der Aufrechterhaltung der Funktion zahlreicher Gewebe spielen. Mutationen im LMX1B-Gen führen zum Auftreten des Nagel-Patella-Syndroms (NPS), einer seltenen autosomal dominant vererbten Erkrankung, die nach ihren hervorstechendsten Merkmalen, einer Hypo- bzw. Dysplasie der Fingernägel gemeinsam mit hypoplastischen bzw. fehlenden Kniescheiben benannt ist. Zusätzlich können mannigfaltige, andere Anomalien auftreten, wobei eine fakultative Beteiligung der Niere die Prognose des Patienten bestimmt. Studien an Lmx1b-Knockout-Mäusen lieferten erste funktionelle Daten zu Lmx1b. Um die Mechanismen der transkriptionalen Regulation durch LMX1B und auch dessen Zielgene aufzuklären, bedarf es allerdings einer weiteren, molekularen Charakterisierung. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, monoklonale Antikörper gegen LMX1B zu entwickeln und diese anschließend zu charakterisieren. Hierzu wurden Balb/c-Mäuse mit zwei Peptiden (Amino- und Carboxy-Terminus von LMX1B) immunisiert, Milzlymphozyten aus den Mäusen isoliert und mit Myelomzellen fusioniert. Nach Vortests konnten insgesamt 5 Klone für die Subklonierung ausgewählt werden konnten: die gegen das NH2-terminale Peptid hLMX1B (1-53) gerichteten Klone 422-19 und 422-76 und die gegen das COOH-terminale Peptid hLMX1B (322-395) gerichteten Klone 193-16, 193-67 und 193-68. Nach Abschluss von insgesamt zwei Subklonierungsschritten erfolgte eine finale Charakterisierung der generierten Antikörper mittels ELISA, Western Blot, Immunpräzipitation, Chromatin-Immunpräzipitation und Immunzytochemie. Zusätzlich gelang es mit Hilfe der generierten Antikörper Lmx1b in Vollzelllysat aus murinen Podozytenzellen und Rattenglomeruli mittels Immunpräzipitation nachzuweisen. Ausgehend von bisher erhobenen Daten hinsichtlich der Transkriptions-regulatorischen Funktion von LMX1B ist zu vermuten, dass LMX1B nicht alleine agieren kann, sondern Co-Faktoren benötigt, welche auch die Gewebe-spezifischen Aktivitäten von LMX1B während der Entwicklung von Niere, Gliedmaßen, Auge und Hirn beeinflussen. LDB1 stellte hierfür einen viel versprechenden Kandidaten dar; inwiefern LMX1B und LDB1 auch in Podozyten interagieren sowie die physiologische Relevanz der Interaktion war bis dato jedoch vollkommen unklar. Unter Verwendung des im Rahmen dieser Arbeit generierten Antikörpers 193-67 konnte nun mit Hilfe von Co-Immunpräzipitations-Experimenten die Interaktion von Lmx1b und Ldb1 in Podozyten (aus Rattenglomeruli) erstmals gezeigt werden. Überdies erbrachten erste Versuche zur Etablierung der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) positive Resultate. Zusammenfassend stellen die entwickelten Antikörper also leistungsfähige und unverzichtbare Werkzeuge dar, um die Funktion von LMX1B hinsichtlich Interaktionspartnern und Zielgenen weiter aufzuklären.
Translation of the abstract (English)
LMX1B is a member of the LIM-homeodomain family of transcription factors, which play a fundamental role in pattern formation during development and in maintenance of function in several tissues. Mutations in the LMX1B-gene cause a rare, autosomal dominant inherited disorder called nail patella syndrome (NPS) characterized by its most outstanding features: Hypo- or dysplasia of the nails together ...
Translation of the abstract (English)
LMX1B is a member of the LIM-homeodomain family of transcription factors, which play a fundamental role in pattern formation during development and in maintenance of function in several tissues. Mutations in the LMX1B-gene cause a rare, autosomal dominant inherited disorder called nail patella syndrome (NPS) characterized by its most outstanding features: Hypo- or dysplasia of the nails together with hypoplastic or missing patellas. Besides a broad range of other anomalies the optional nephropathy is the most serious aspect of NPS. Although studies in Lmx1b null mice gave first functional data, the mechanism of transcription regulation by LMX1B and its target genes still remain unclear. The goal of this work was to generate and characterize monoclonal antibodies against LMX1B. Therefore Balb/c-mice were immunized using two different, recombinant peptides (the amino- and carboxy-terminus of LMX1B). After splenectomy was done, spleen lymphocytes were isolated and fused with myeloma cells. Based on preliminary tests a total of 5 clones were subcloned: 422-19 and 422-76 directed against amino acid 1-53 of LMX1B; 193-16, 193-67 and 193-68 directed against amino acid 322-395 of LMX1B. After two steps of subcloning a final characterization was performed using ELISA, Western blot, immuno-precipitation, chromatin-immuno-precipitation (ChIP) and immuno-cytochemistry. Additionally endogenous Lmx1b could be detected in whole cell lysate of murine podocytes und rat glomeruli. Based on functional data it is obvious that LMX1B cannot act by itself but rather needs additional co-factors, which may also help to determine the tissue-specific activities of LMX1B during kidney, limb, eye and brain development. Concerning co-factors LDB1 is a promising candidate. It was not clear, however, whether LDB1 is expressed in the podocyte, whether the interaction between LMX1B and LDB1 also takes place in podocytes and whether this interaction is essential for podocyte function. In this work the interaction between Lmx1b and Ldb1 in podocytes (rat glomeruli) could be shown for the first time using one of the generated monoclonal antibodies. Moreover preliminary ChIP-experiments yielded promising results towards to identification of target genes. In summary the generated, monoclonal antibodies are powerful and indispensable tools to further elucidate the role of LMX1B concerning interaction partners and target genes.
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