Zum Aufbau einer differenzierten, transparenten und gefäßfreien Kornea ist die Expression zahlreicher Gene notwendig, deren Natur nicht vollständig geklärt ist. Diese Expression ist gestört bei der Wundheilung der Kornea, die zu einer undurchsichtigen Narbe führen kann, ein Vorgang, bei dem Signale von TGF-β1 eine wichtige Rolle spielen. Auch im Tiermodell führt die Überexpression von TGF-β1 im ...
Abstract (German)
Zum Aufbau einer differenzierten, transparenten und gefäßfreien Kornea ist die Expression zahlreicher Gene notwendig, deren Natur nicht vollständig geklärt ist. Diese Expression ist gestört bei der Wundheilung der Kornea, die zu einer undurchsichtigen Narbe führen kann, ein Vorgang, bei dem Signale von TGF-β1 eine wichtige Rolle spielen. Auch im Tiermodell führt die Überexpression von TGF-β1 im vorderen Augenabschnitt transgener βB1-Crystallin-TGF-β1 Mäuse zur Ausbildung einer undurchsichtigen, vaskularisierten Kornea. In der vorliegenden Arbeit sollte durch den Vergleich der Genexpression in der Kornea von βB1-Crystallin-TGF-β1 Mäusen mit der von wildtypischen Kontrolltieren ein kompletteres Bild der Gene identifiziert werden, die für die Ausbildung einer differenzierten, transparenten Kornea notwendig sind.
Die Hornhäute von transgenen und wildtypischen Mäusen wurden am ersten Tag nach der Geburt mikroskopisch präpariert, um daraus RNA für eine Mikroarray-Analyse zu isolieren. Die nach der Analyse gewonnenen Daten wurden charakterisiert und differentiell exprimierte Gene bestimmten Funktionsgruppen zugeordnet.
Mit diesem Ansatz konnten über 200 Gene mit unterschiedlichsten molekularen Funktionen identifiziert werden, die von TGF-β1 reguliert werden. Insbesondere konnte ein umfangreicher Einblick in die Auswirkungen von TGF-β1 auf Synthese von Bestandteilen der extrazellulären Matrix, auf Angiogenese und auf Zell-Zell-Kommunikation erreicht werden. Besonders auffallend war dabei die differentielle Regulation der Genexpression des kornealen extrazellulären Matrixproteins Laminin 5 und des Intermediärfilaments Keratin 14, welches als möglicher Marker für Progenitorzellen des Korneaepithels nachgewiesen wurde. Ebenso konnten Prostaglandin D2 Synthase (Ptgds) und Early Growth Response 2 (Egr2) als Marker der neuronalen und kornealen Differenzierung in der undifferenzierten transgenen Kornea von βB1-Crystallin-TGF-β1 Mäusen als differentiell reguliert beobachtet werden. Auch wurde die Hochregulation des Chemokinliganden BRAK beobachtet, welcher ein antiangiogenetischer Faktor ist und von Follistatin, welches eher angiogenetische Funktionen hat. Die differentielle Regulation der für Connexine von Gap Junctions kodierenden Gene lieferte interessante Hinweise auf die mögliche Bedeutung, die TGF-β1 für die Homöostase der interzelluläre Kommunikation und Differenzierung des kornealen Zellsystems haben könnte.
Insgesamt wurden in dieser Arbeit potenzielle Zielgene der Regulation durch TGF-β1 identifiziert und dadurch zukünftige Möglichkeiten der Anwendung in Therapie und Forschung aufgezeigt. Erforderlich wird es allerdings nun sein, die aus der Microarray-Analyse gewonnenen Erkenntnisse in einem zweiten unabhängigen Assay, z. B. durch semiquantitative RT-PCR zu bestätigen. Zukünftige Untersuchungen werden zudem zeigen müssen, wie sich die Regulation der Expression auf Ebene der mRNA in der Proteinbiosynthese widerspiegelt. Westernblot und Immunoblot Untersuchungen bieten dafür gute Möglichkeiten, ebenso wie die Anfertigung von histologischen Schnitten in Spezialfärbungen und Immunhistochemie.
Translation of the abstract (English)
For the structure of a differentiated, transparent and avascular cornea, the expression of numerous genes is necessary, the nature of which is not fully known. Corneal gene expression is impaired during corneal wound healing, a process which can result in opaque scars and where signals driven by TGF-β1 play an important role. In the mouse model of transgenic βB1-crystallin-TGF-β1 mice, the ...
Translation of the abstract (English)
For the structure of a differentiated, transparent and avascular cornea, the expression of numerous genes is necessary, the nature of which is not fully known. Corneal gene expression is impaired during corneal wound healing, a process which can result in opaque scars and where signals driven by TGF-β1 play an important role. In the mouse model of transgenic βB1-crystallin-TGF-β1 mice, the overexpression of TGF-β1 in the anterior segment results in an opaque, vascularised cornea. This work was aimed to identify a more complete picture of the genes that are critically required for the development of a differentiated, transparent cornea through comparative gene expression analysis in the cornea of transgenic βB1-crystallin-TGF-β1 mice and wildtype littermates. The corneas of transgenic and wildtype mice were isolated microscopically to obtain RNA for microarray analysis. Data gathered by the analysis were characterized and differentially expressed genes were grouped according to their function. Accordingly, more than 200 genes with a multitude of functions could be identified which were found to be regulated by TGF-β1. Especially, a deeper insight into the effects of TGF-β1 on extracellular matrix (ECM) synthesis, angiogenesis and cell-cell communication was obtained. Quite remarkable was the differential regulation of the gene expression of the corneal extracellular matrix protein laminin 5 and the intermediary filament keratin 14, which was shown to be a potential marker for corneal epithelial progenitor cells. Furthermore, prostaglandin D2 synthase (ptgds) and early growth response 2 (egr2) -both markers of neuronal and corneal differentiation- were seen to be differentially regulated in the undifferentiated cornea of βB1-crystallin-TGF-β1 transgenic mice. Moreover, upregulation of the chemokin ligand BRAK, which is an antiangiogenetic factor, and of follistatin, which has more angiogenetic effects could be detected. The differential regulation of genes coding for connexins- i.e. proteins of gap junctions- showed interesting details concerning potential roles of TGF-β1 for the homeostasis of intercellular communication and differentiation of the corneal cell system. In summary, potential target genes regulated by TGF-β1 were identified and the possible relevance for corneal pathology and therapy was shown. Certainly further independent examinations- e. g. semiquantitative real time polymerase chain reaction- will be needed to verify the scientific findings gained through the microarray analysis. Moreover, future investigations will have to show if the differential expression of mRNA levels will result in translation of the respective proteins. Western blot and immunoblot experiments are possible tools for this, or histological imaging and immunohistochemistry.
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