New fluorescent probes and assays for lactate and hydrogen peroxide

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Grögel, Dominik Berndt Michael

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Date of publication of this fulltext: 28 Sep 2011 06:25

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Date:	28 September 2011
Referee:	Prof. Dr. Otto S. Wolfbeis
Date of exam:	1 September 2011
Institutions:	Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Chemo- und Biosensorik (Prof. Antje J. Bäumner, formerly Prof. Wolfbeis)
Keywords:	fluorophore, oxidase, cyanine, horseradish peroxidase, photoinduced electron transfer, glucose, Farbstoff, Oxidase, Cyaninfarbstoff, Meerrettich Peroxidase, photoinduzierter Elektronentransfer, Glucose
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 540 Chemistry & allied sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	22173

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Abstract (English)

Abstract (English)

Novel fluorescent probes and methods for the determination of lactate and hydrogen peroxide (HP) are presented.
The first part describes the design and preparation of two fluorescent probes for HP. The naphthalimide fluorophores 5 (which is referred to as HP Green) and 8 have either a p-anisidine (HP Green) or N,N-dimethyl-p-phenylene diamine (8) group attached as a redox active moiety. Both probes display absorption around 450 nm and emission at 534 nm. HP Green is more suitable for experiments under physiological conditions. Photoinduced electron transfer from the redox moiety to the fluorophore is suppressed after oxidation with HP. This effect is further increased in presence of horseradish peroxidase (HRP), and fluorescence rises up to 11-fold. The dynamic range of HP Green for HP is from 100 nM to 5 µM with a limit of detection (LOD) of 64 nM. L-Lactate detection affords lactate oxidase in combination with HP Green and HRP to yield a fast enzymatic assay (6 min). The dynamic range is from 0.5 to 10 µM of L-lactate with a LOD of 162 nM, which is 6-fold lower than methods that apply Amplex Red (LOD 1 µM). Furthermore, a D-glucose assay with glucose oxidase was established, which has a dynamic range from 2 to 30 µM. The LOD of 0.64 µM is 3-fold lower than that of the respective Amplex Red system (2 µM). HP Green also was applied as an in-vitro probe for imaging of HP in NRK cells. Finally, the feasibility of a reusable chemosensor for HP is shown.
The second part aims at the development of probes that directly bind lactate upon covalent interactions. Phenylboronic acids are connected to either a hemicyanine fluorophore (10) or ruthenium(II)-complexes (12a/b). Upon excitation at 460 nm, all fluorophores emit red light around 610 nm and differ in their response to both lactate enantiomers. The experiments hint at boronic acids being suitable to the detection of lactate and to differentiate between the two enantiomers. However the presence of saccharides must be avoided.
In the last part, the blue cyanine dyes 13 and 14 were shown to change their colour to purple in acidic aqueous solutions. Changes occur faster for derivative 14, hence, the purple decomposition product of 14 was isolated with preparative HPLC and its molecular weight was determined to be 754.3 g/mol. The dye displays absorption at 534 nm and two emission maxima at 547 and 588 nm. Finally, a colorimetric sensor for acidic gases was developed exploiting the chameleon properties of 14 in presence of gaseous hydrochloric acid. The sensor changes its colour from blue to purple upon exposition to low amounts of gaseous HCl (0.1 µbar), and high partial pressures of HCl can accelerate the response to less than 30 min.

Translation of the abstract (German)

Im Rahmen dieser Arbeit werden neue fluoreszierende Farbstoffe und Methoden zur Bestimmung von Laktat und Wasserstoffperoxid (HP) vorgestellt.
Der erste Teil beinhaltet die Synthese zweier neuer Farbstoffe für den Nachweis von HP. An die Naphthalimidfluorophore 5 (HP Green genannt) und 8 sind entweder p-Anisidin (HP Green) oder N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin (8) als redoxaktive Gruppen gebunden. Beide Farbstoffe zeigen Absorptionsmaxima um 450 nm und Emissionsmaxima bei 534 nm. HP Green ist für Messungen unter physiologischen Bedingungen besser geeignet. Die Oxidation durch HP unterdrückt den photoinduzierten Elektronentransfer von der redoxaktiven Gruppe zum Fluorophor wobei ein schwacher Anstieg der Fluoreszenz zu beobachten ist. Dieser Effekt wird durch Zugabe von Meerrettich Peroxidase (HRP) enorm verstärkt, wodurch die Fluoreszenz um das Elffache steigt. Der Nachweisbereich von HP Green erstreckt sich von 0,1 bis 5 µM HP, mit einer Nachweisgrenze von 64 nM. Zur Bestimmung von L-Laktat müssen Laktatoxidase, HP Green und HRP für 6 min inkubiert werden. L-Laktatkonzentrationen können von 0,5 bis 10 µM bestimmt werden bei einer Nachweisgrenze von 162 nM. Des Weiteren wurde ein enzymatischer Assay für D-Glucose in Gegenwart von Glucoseoxidase entwickelt, mit dem Glucosekonzentrationen von 2 bis 30 µM bestimmt werden können. Die Nachweisgrenze beträgt 0,64 µM. Beide enzymatische Assays zeigen niedrigere Nachweisgrenzen als die etablierten Amplex Red Systeme. HP Green wurde weiterhin mit NRK-Zellen inkubiert und nach Aufnahme von HP dessen Nachweis in Zellen in-vitro über Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. Zusätzlich wird die Machbarkeit eines wiederverwendbaren Chemosensors für HP gezeigt.
Der zweite Teil beinhaltet die Entwicklung von Farbstoffen, die direkt über kovalente Wechselwirkungen an Laktat binden (Kapitel 4). Dazu wurden Phenylboronsäuren entweder an einen Hemicyaninfarbstoff (10) oder an Ru(II)-Komplexe gebunden (12a,b). Nach Anregung bei 460 nm emittieren alle Fluorophore rotes Licht um 610 nm, unterscheiden sich aber in ihrer Wechselwirkung mit beiden Laktat-Enantiomeren. Die Boronsäurefarbstoffe können in gewissen Konzentrationsbereichen Laktat enantioselektiv nachweisen, jedoch nur unter Ausschluss von Sacchariden.
Zuletzt werden zwei blaue Cyaninfarbstoffe 13 und 14 gezeigt, die ihre Farbe in sauren wässrigen Lösungen zu purpurrot ändern. Das purpurrote Zersetzungsprodukt von 14 wurde mit präparativer HPLC isoliert und sein Molekulargewicht zu 754,3 g/mol bestimmt. Der Farbstoff absorbiert bei 534 nm und emittiert bei 547 und 588 nm. Der Farbumschlag von 14 in Gegenwart von gasförmiger Salzsäure wurde zur Entwicklung eines kolorimetrischen Sensors für saure Gase genutzt. Hohe Partialdrücke an HCl verringern die Ansprechzeit des Sensors auf bis zu 30 min.

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