Ficolins are members of the collectin family of proteins which in human and mice are able to recognize pathogen associated molecular patterns (PAMPs) on microbial surfaces. Ficolins trigger the activation of the innate immune system by initiating the complement cascade in serum upon binding to their specific PAMPs. Our group recently published the first observation on the cellular localization of ...
Zusammenfassung (Englisch)
Ficolins are members of the collectin family of proteins which in human and mice are able to recognize pathogen associated molecular patterns (PAMPs) on microbial surfaces. Ficolins trigger the activation of the innate immune system by initiating the complement cascade in serum upon binding to their specific PAMPs. Our group recently published the first observation on the cellular localization of mouse ficolin-B. In contrast to the human ortholog M-ficolin which is secreted, ficolin-B was only detected intracellularly in peritoneal macrophages (Runza et al., 2006). Investigations on the expression profile in our laboratory indicated that ficolin-B expression is down-regulated upon maturation of myeloid cells such as macrophages, granulocytes, and bone marrow-derived dendritic cells suggesting a critical role of ficolin-B during early stages of cell activation upon pathogen encounter. In contrast to others who have shown that ficolin-B does not associate to serine proteases and, therefore, is unable to activate the complement system (Endo et al., 2005) unpublished findings by our group show complement activation by ficolin-B. However, the biological relevance of these findings and the function of mouse ficolin-B upon bacterial challenge remains to be elucidated. An established method for the recombinant production of ficolin-B in an eukaryotic (insect) expression (DS2 cells) system exists in our lab. This method is, however, expensive and time consuming. The first goal of this work was to establish an alternative expression system in E. coli to produce recombinant ficolin-B without tag. The biological activity of the E. coli-expressed ficolin-B was to be compared to the activity of the DS2-expressed ficolin-B. The protein should then be used to immunize rats to generate monoclonal antibodies. In the second part of the project functional characterization of ficolin-B through mutational analysis should be tested. Ficolin-B muteins are expected to define the differences in fine specificity as shown by Xenopus, mouse, and human ficolins and, as such, bring evidence for adaptive changes during evolution. Ficolin-B has a conserved collagen binding site (Girija et al., 2007) that has been linked to important functions such as lectin pathway activation and collaboration with the blood coagulation system by interacting with serine proteases like MASPs (Endo et al., 2010). Weak adjacent sites of the MASP binding domain may enhance or decrease affinity for binding, but little is known about the biological role of this affinity modulation. The aim was to alter the biological activity of ficolin-B by introduction of a single amino acid mutation in the collagen like domain. Protein biochemical and chromatographic studies were performed to compare the ficolin-B wild type and mutant forms.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Ficoline sind Mitglieder der Collectin-Proteinfamilie, die in Mensch und Maus Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMP) auf Oberflächen erkennen. Ficoline starten das angeborene Immunsystem, indem sie im Serum nach Bindung an spezifische PAMP die Complement-Kaskade aktivieren. Unsere Arbeitsgruppe zeigte als erste, dass Maus-Ficolin-B intrazellulär lokalisiert ist. Im Gegensatz zum humanen ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Ficoline sind Mitglieder der Collectin-Proteinfamilie, die in Mensch und Maus Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMP) auf Oberflächen erkennen. Ficoline starten das angeborene Immunsystem, indem sie im Serum nach Bindung an spezifische PAMP die Complement-Kaskade aktivieren. Unsere Arbeitsgruppe zeigte als erste, dass Maus-Ficolin-B intrazellulär lokalisiert ist. Im Gegensatz zum humanen Ortholog, M-Ficolin, wurde Ficolin-B nur intrazellulär in Peritonealmakrophagen nachgewiesen (Runza et al., 2006). Untersuchungen zum Expressionsprofil aus unserem Labor zeigten, dass Ficolin-B während der Reifung myeloider Zellen, wie Makrophagen, Granulozyten und vom Knochenmark abgeleiteten Dendritischen Zellen, herunterreguliert wird, was für eine wichtige Funktion von Ficolin-B in den frühen Stadien der Zellaktivierung nach Pathogen-Kontakt spricht. Ebenfalls im Gegensatz zu Befunden anderer Gruppen, die zeigten, dass Ficolin-B nicht mit Serinproteasen assoziiert und daher unfähig ist, das Complementsystem zu aktivieren (Endo et al. 2005), finden wir eine Aktivierung des Complementsystems durch Ficolin-B (unveröffentlicht). Die biologische Bedeutung dieser Befunde und die Funktion von Maus-Ficolin-B nach bakterieller Belastung müssen jedoch noch geklärt werden. Eine Methode zur Produktion von rekombinantem Ficolin-B in Insekten(DS2)-Zellen ist in unserem Labor etabliert. Die Methode ist jedoch teuer und langwierig. Das erste Ziel dieser Arbeit war es, ein alternatives Expressionsystem in E. coli zu etablieren, um rekombinantes Ficolin-B ohne Tag zu produzieren. Die biologische Aktivität des E. coli-exprimierten Ficolin-B sollte mit der Aktivität von DS2-Zellen-exprimiertem Ficolin-B verglichen werden. Das Protein selbst sollte zur Immunisierung von Ratten zur Herstellung monoklonaler Antikörper dienen. Im zweiten Teil des Projektes sollte Ficolin-B funktionell durch Mutations-Analyse charakterisiert werden. Ficolin-B-Muteine könnten Spezifitätsunterschiede erklären, wie schon für adaptive Veränderungen während der Evolution durch Vergleich von Xenopus-, Maus- und Mensch-Ficolin-B-Ortholog geschehen. Ficolin-B hat eine konservierte Collagen-Bindungsstelle (Girija et al., 2007), die mit den wichtigen Funktionen wie Lektinweg-Aktivierung und Interaktion mit dem Gerinungssystem durch Interaktion mit Serinproteasen wie MASP verknüpft ist (Endo et al., 2010). Schwache benachbarte Bindungsstellen der Bindungsstelle können die Affinität erhöhen oder erniedrigen, wobei wenig über die biologische Rolle dieser Affinitätsmodulation bekannt ist. Durch Mutation einer einzigen Aminosäure in der Collagen-Bindungsstelle von Ficolin-B sollte die biologische Aktivität verändert werden. Biochemische und chromatographische Untersuchungen sollten durchgeführt werden, um Wild-Typ- und Mutein-Ficolin-B zu vergleichen.
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