| License: Publishing license for publications including print on demand (6MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-230198
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.23019
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 12 July 2012 |
| Referee: | Prof. Dr. Hans-Achim Wagenknecht and Prof. Dr. Otto S. Wolfbeis |
| Date of exam: | 16 December 2011 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Organische Chemie > Alumni or Retired Professors > Arbeitskreis Prof. Dr. Hans-Achim Wagenknecht |
| Keywords: | DNA, Cyanin Farbstoff, Fluoreszenz, Nanopartikel, Bioanalytik |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 23019 |
Abstract (German)
Die Bioanalytik bildet die Grundlage für das Verständnis der Prozesse unserer DNA und RNA. Der Weiterentwicklung bioanalytischer Methoden kommt daher eine große Bedeutung zu. Im Rahmen dieser Arbeit werden zwei Arten fluoreszenter DNA-Sonden weiterentwickelt und auf ihre Anwendbarkeit für bioanalytische Methoden untersucht. Der Hauptteil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung des ...
Abstract (German)
Die Bioanalytik bildet die Grundlage für das Verständnis der Prozesse unserer DNA und RNA. Der Weiterentwicklung bioanalytischer Methoden kommt daher eine große Bedeutung zu. Im Rahmen dieser Arbeit werden zwei Arten fluoreszenter DNA-Sonden weiterentwickelt und auf ihre Anwendbarkeit für bioanalytische Methoden untersucht.
Der Hauptteil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung des klickbaren Cyaninfarbstoffs CyIQ (Cyanine Indole Quinoline), dem Aufbau funktioneller DNA-Sonden und dem bioanalytischen Einsatz dieser Sonden. Zunächst wurde eine Synthesestrategie entwickelt mit der CyIQ postsynthetisch an jede beliebige Stelle der DNA verknüpft werden kann. Dazu wurde der Farbstoff mit einem kurzen Propylazid-Linker versehen, über den durch eine kupferkatalysierte Huisgen-Cycloaddition der Chromophor an ein alkinmodifiziertes Uridin verknüpft werden kann. Die Klick-Konjugation von CyIQ verläuft dabei mit Ausbeuten über 70 % und der Farbstoff bleibt stabil. Im Vergleich zu einem Einbau während der DNA-Festphasen-synthese wird dabei nur ein Zehntel an Farbstoffsubstanz benötigt. Kovalent in DNA gebunden zeigt CyIQ eine breite Absorptionsbande zwischen λ = 400 nm und 550 nm mit einem Maximum bei 495 nm. Der Extinktionskoeffizient bewegt sich dabei typischerweise bei ε495 = 60.000 L mol-1 cm-1. Angeregt bei λexc = 495 nm fluoresziert CyIQ typischerweise im Bereich von λ = 500 – 700 nm mit einem Maximum bei λ = (560 ± 10) nm. Die Emission erfolgt also mit einer Stokes-Verschiebung von ca. λ = 75 nm. Die Fluoreszenzquantenausbeuten bewegen sich bei Einfacheinbauten um 8 %. Mit einer durchschnittlichen Helligkeit von 5600 ist CyIQ mit Thiazolorange vergleichbar, erreicht aber nur ein Drittel der Helligkeit von Cy3 in vergleichbaren DNA-Strängen. Nach Untersuchung der Redoxeigenschaften hat sich gezeigt, dass CyIQ in der Lage ist Guanin zu oxidieren. In Titrationsexperimetne steigt die Fluoreszenz von CyIQ um das siebzenfache an. Mit Ethidiumbromid erhält man in vergleichbaren Experimenten nur einen zehnfachen Anstieg. Ein wichtiges Kriterium in bioanlytischen Anwendungen ist die Photostabilität eines Chromophors. Daher wurde CyIQ mit Cy3, Thiazolrot, Thiazolorange, BODIPY und Fluorescein in DNA verglichen. Nach 30-minütiger Bestrahlung sind von CyIQ und Cy3 immer noch über 90 % der ursprünglichen Fluoreszenz vorhanden wobei die anderen Farbstoffe bereits zur Hälfte oder ganz ausgeblichen sind. Erst nach zwanzigstündiger Bastrahlung sind nur noch 20 % der CyIQ-Emission vorhanden. Im Anschluss wurden eine ganze Reihe unterschiedlicher DNA-Sonden mit Farbstoff-Dimeren synthetisiert und deren photophysikalische Wechselwirkungen untersucht. Darunter auch FRET-Sonden aus CyIQ und Thiazolrot, da sich CyIQ durch seine relativ große Stokes Verschiebung gut als FRET-Donor eignet. Der beste Erfolg konnte jedoch mit einem CyIQ-Dimer in einer Intrastrang Anordnung erzielt werden. Dabei ist die Fluoreszenz der Sonde im Einzelstrang stark gelöscht. Erst durch Hybridisierung mit dem korrekten Gegenstrang zeigt die Sonde intensive Fluoreszenz. Mit dieser Sonde war es möglich Basenfehlpaarungen in DNA über den Bereich eines ganzen Codons zu detektieren, was CyIQ für die Erkennung von Einzelbasenpolymorphismen (SNPs) interessant macht. Abschließend wurde eine CyIQ-DNA-Sonde erstmals in einem korrelativen Ansatz aus Licht- und Elektronenmikroskopie im Bereich der analytischen Zellbiologie eingesetzt. Dabei gelang es in Echtzeit am Fluoreszenzmikroskop den Weg der DNA, eingehüllt in Lipoplexe, in Zellen zu verfolgen. Da CyIQ durch eine photoinduzierte Reaktion mit Diaminobenzidin eine lokale Polymerisation initiiert, war es anschließend möglich unter dem Elektronenmikroskop in Zellschnitten die exakte Position der Sonde auf ihrem Weg vom Extrazellulärraum bis hin zum Zellkern zu verfolgen. Die Sonde wird derzeit am Tiermodell validiert. Fazit: Es konnte gezeigt werden, dass CyIQ schnell, postsynthetisch und mit geringem Einsatz von Substanz an beliebige Stellen von Oligomeren geklickt werden kann. Dabei zeigt CyIQ interessante photophysikalische Eigenschaften. Die Kombination aus hoher Photostabilität und großer Stokes Verschiebung macht CyIQ zu einer interessanten Alternative zu Fluorescein, FAM™, Atto® 495 bzw. 520, Alexa Fluor 500® , Thiazolorange und vergleichbaren Farbstoffen. Aus ersten bioanalytischen Versuchen geht hervor, dass sich CyIQ-DNA-Sonden gut für fluoreszenzmikroskopsiche oder korrelative Anwendungen aus Licht- und Elektronenmikroskopie eignen. Auch ein Einsatz in der DNA-Analytik ist denkbar. Die Verknüpfung über ein Uridin schafft zusätzlich die Möglichkeit der Übertragung auf RNA, was das Anwendungsspektrum des Fluorophors zusätzlich erweitert.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wird eine Methode zur Funktionalisierung von Upconversion Nanopartikeln mit DNA entwickelt, die ebenfalls auf der kupferkatalysieten1,3-Dipolaren Cycloaddition zwischen Alkinen mit Aziden beruht. Dafür wurden Oligomere am 3´- oder 5´-Ende mit einem 2´-O-Propargyluridin synthetisiert und an die azidmodifizierte Oberfläche von Upconversion Nanopartikeln verknüpft. Die erfolgreiche Konjugation konnte durch IR-Spektroskopie, Hybridisierungsversuche und Anfärbung mit Ethidiumbromid nachgewiesen werden. Die Aufreinigung der Nanopartikel-Konjugate und die Abtrennung überschüssiger Oligomere erfolgt durch eine Temperaturoptimierte Gelpermeationschromatographie (GPC). Die herausragende Eigenschaft von Upconversion Materialien ist deren Emission im Sichtbaren, bei Anregung im Infraroten Spektralbereich. Diese Eigenschaft macht Upconversion-Nanopartikel interessant für bioanalytische Anwendungen was auch für die DNA-funktionalisierten Partikel überprüft wurde. Dabei konnte gezeigt werden dass sowohl unmodifizierte als auch DNA-modifizierte Upconversion-Nanopartikel in der Lage sind Zellmembranen zu überwinden und dabei deutliche Fluoreszenzsignale liefern. DNA verleiht den Nanopartikeln eine sequenzspezifische Erkennbarkeit. Diese Möglichkeit der molekularen Erkennung wurde durch DNA-gesteuerte Aggregation komplementärer Nanopartikel nachgewiesen. Besonders eindrucksvoll ist die Aggregation zu flockigen Niederschlägen bei Zugabe einer Ziel-DNA zu nicht komplementären Nanopartikeln. In Cytotoxizitäts-Assays stellte sich schließlich heraus, das die in dieser Arbeit verwendeten DNA-modifizierten Upconversion-Nanopartikel toxischer sind als unmodifizierte. Als Hauptgrund werden verschleppte Kupferionen der Klick-Reaktion diskutiert. Dieses Ergebnis liefert wichtige Erkenntnisse für den stetig wachsenden Einsatz der Klick-Konjugation in bioanalytischen Systemen. Bei zukünftigen Anwendungen dieser Reaktion muss dieses Problem berücksichtigt werden und gegebenenfalls auf etablierte Methoden oder Kupfer freie Klick-Reaktionen, z. B. über Cyclooctine zurückgegriffen werden. Prinzipiell konnte jedoch gezeigt werden, dass Upconversion-Nanopartikel durch die Kombination mit DNA zusätzliche Funktionen erhalten und dadurch ihr Anwendungsspektrum erweitern können.
Translation of the abstract (English)
Bioanalysis is the basis for understanding the processes of our DNA and RNA. The development of bioanalytical methods is therefore of great importance. In this study, two types of fluorescent DNA probes are developed and evaluated for their applicability for bioanalytical methods. The main part of this work deals with the development of the clickable cyanine dye CyIQ (Cyanine Indole Quinoline), ...
Translation of the abstract (English)
Bioanalysis is the basis for understanding the processes of our DNA and RNA. The development of bioanalytical methods is therefore of great importance. In this study, two types of fluorescent DNA probes are developed and evaluated for their applicability for bioanalytical methods.
The main part of this work deals with the development of the clickable cyanine dye CyIQ (Cyanine Indole Quinoline), the construction of functional DNA probes and the exploration of the bioanalytical use of these probes. First, a synthesis strategy was developed to link CyIQ post-synthetically to any position of oligonucleotides. For this purpose, the dye was accompanied by a short propylazide linker and conjugated by the copper-catalyzed Huisgen-cycloaddition to an alkyne-modified uridine. The click conjugation of CyIQ runs with yields above 70% and the dye remains stable. Compared to an incorporation during solid phase DNA synthesis, only one-tenth of dye substance is needed. Covalently bound to DNA, CyIQ shows a broad absorption band between λ = 400 nm and 550 nm with a maximum at 495 nm (ε495 = 60,000 L mol-1 cm-1). Excited at 495 nm CyIQ fluoresces typically in the range of λ = 500 - 700 nm with a maximum at λ = (560 ± 10) nm which corresponds to a Stokes shift of about λ = 75 nm. The fluorescence quantum yields move around 8%. With an average brightness of 5600 CyIQ is comparable with Thiazoleorange, but reaches only a third of the brightness of Cy3 in comparable DNA strands. After studying the redox properties it became clear, that CyIQ is able to oxidize guanine. In titration experiments a seventeen fold increase of fluorescence was observed. In similar experiments, Ethidium Bromide reached only a ten-fold increase. An important criterion in bioanalytical applications is the photostability of chromophors. Therefore CyIQ was compared with Cy3, Thiazolred, Thiazole Orange, BODIPY and Fluorescein in DNA. After a 30-minute irradiation of CyIQ and Cy3 still over 90% of the original fluorescence remain while the other dyes are faded half or completely. Only after twenty hours of irradiation only 20% of the original CyIQ emissionsare present. Following a number of different DNA probes with dye-dimers were synthesized and their photophysical interactions were studied. The best success could be achieved with a dimer in a CyIQ intrastrand arrangement. Here, the fluorescence of the probe is quenched in the single-strand. Only by hybridization with the correct counter strand, the probe shows intense fluorescence. With this probe it was possible to detect single base mismatches in DNA over the range of an entire codon which makes CyIQ an interesting tool for SNP-detection. Finally, a CyIQ DNA probe was first used in a correlative approach of light and electron microscopy in analytical cell biology. It succeeded to pursue the path of DNA wrapped in lipoplexes into cellsby real time fluorescence microscopy. Since CyIQ initiates local polymerization by a photoinduced reaction with diaminobenzidine, it was then possible to follow the exact position of the probe on its way from the extracellular space to the nucleus by electron microscopy. The probe is currently being validated in animal models.
In the second part of this work a method for the functionalization of upconversion nanoparticles with DNA is developed, which is also based on the copper-catlyzed 1 ,3-dipolar cycloaddition of alkynes with azides. Oligomers with a 2'-O-Propargyluridin on the 3´- or 5´-end were synthesized and linked to the azide-modified surface of upconversion nanoparticles. The successful conjugation could be detected with ethidium bromide staining, hybridization experiments and by infrared spectroscopy. Purification of the nanoparticle conjugates and the removal of excess oligomers are optimized by a temperature gel permeation chromatography (GPC). The outstanding feature of upconversion materials is their emission in the visible, with excitation in the infrared spectral region. This property makes upconversion nanoparticles interesting for bioanalytical applications. We could show that both unmodified and modified DNA upconversion nanoparticles are able to overcome cell membranes and provide distinct fluorescence signals in cells. DNA gives nanoparticles the possibility of sequence-specific recognition. This possibility of molecular recognition has been demonstrated by complementary DNA-directed aggregation of nanoparticles. Particularly impressive is the aggregation of flocculent precipitates upon the addition of a complementary target DNA to nanoparticles. In cytotoxicity assays it turned out that the DNA-modified upconversion nanoparticles used in this work are more toxic than unmodified. Copper ions from the click reaction seem to be the main reason for this observation. This result provides important insights for the growing use of the click conjugation in bioanalytical systems. For future applications this problem must be taken into consideration and if necessary, a copper-free click reaction (e. g. with cyclooctynes) has to be used. In principle, we could show that upconversion nanoparticles can be modified with DNA by the copper catalyzed cycloaddition of alkines with azides resulting extended properties of upconversion nanoparticles.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 05:31
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