Im Modell der Retinoschisis geht der Photorezeptorapoptose eine Aktivierung von Mikroglia voraus (Gehrig, Langmann et al. 2007). Stap-1 zeigt in aktivierten Mikroglia der RSh1 Knock-Out Maus stark erhöhte Expressionswerte. Ziel dieser Dissertation war den Promotor dieses Gens genauer zu untersuchen, da Stap-1 ein interessantes Ziel sein könnte um die Aktivierung von Mikroglia zu verstehen und ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Im Modell der Retinoschisis geht der Photorezeptorapoptose eine Aktivierung von Mikroglia voraus (Gehrig, Langmann et al. 2007). Stap-1 zeigt in aktivierten Mikroglia der RSh1 Knock-Out Maus stark erhöhte Expressionswerte. Ziel dieser Dissertation war den Promotor dieses Gens genauer zu untersuchen, da Stap-1 ein interessantes Ziel sein könnte um die Aktivierung von Mikroglia zu verstehen und möglicherweise zu beeinflussen bzw. zu limitieren. Da bereits in einer vorhergehenden Arbeit meiner Arbeitsgruppe (Weigelt, Moehle et al. 2008) gezeigt werden konnte, dass der Makrophagen spezifische Transkriptionsfaktor PU.1 an den Stap-1 Promotor bindet, wurde in der vorliegenden Arbeit dessen Einfluss auf die Aktivierung der Stap-1 Transkription betrachtet. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die hauptsächliche Promotoraktivität des Stap-1 Promotors in einer Region nicht weiter als -400bp vom Transkriptionsstartpunkt lokalisiert ist. Es wurden für diese Untersuchung drei Promotorkonstrukte unterschiedlicher Länge verwendet: -1149/-12, -814/-12, -403/-12. Diese Promotorkonstrukte wurden mittels Luciferase Assay auf ihre Aktivität hin untersucht. Die Luciferase Assays wurden in RAW264.7 Zellen, einer Makrophagen Zelllinie, und in BV2 Zellen, einer mikroglialen Zelllinie, durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass auch das kleinste Promotorkonstrukt zur vollen Aktivierung führt. Außerdem konnte die Vermutung bestätigt werden, dass die bereits vorher verifizierte PU.1 Bindestelle wesentlich zur Aktivierung des Stap-1 Promotors beiträgt. Dazu wurde im kleinsten Promotorkonstrukt die PU.1 Bindestelle mutiert und anschließend noch einmal Luciferase Assays mit diesem mutierten und den anderen drei Wildtyp Konstrukten durchgeführt. Die Aktivität im mutierten Konstrukt war signifikant geringer als im gleich großen Wildtyp-Konstrukt. Weitere interessante Untersuchungen wären mit einem noch kürzeren Konstrukt, das gerade noch die PU.1 Bindestelle enthält denkbar. Das hieße, das Konstrukt würde bei -110 bp starten. Außerdem wäre es natürlich interessant, den Einfluß der zweiten PU.1 Bindestelle zu untersuchen. Dazu müsste man neue Konstrukte klonieren, die über den Translationsstartpunkt hinausgehen. Messungen mit solchen Konstrukten scheiterten in dieser Arbeit, hier müsste der Endpunkt des Konstruktes genau überlegt werden. Zur Gewinnung genauerer Kenntnisse über Stap-1, die Aufschluss darüber geben könnten, ob ein Eingriff in die Expression dieses Gens ein therapeutischer Angriffspunkt werden kann, würde sich die Untersuchung eines Stap-1 Knock-Out Modells anbieten.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
In retinoschisis the activation of Microglia precedes photoreceptor apoptosis. (Gehrig, Langmann et al. 2007) Stap-1 shows highly elevated gene expression levels in activated microglia of RSh1 knock-out mice.
Aim of this work was to analyze the promoter of the stap-1 gene, because stap-1 might be an interesting object to better understand microglia activation and possibly influence or limit the ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
In retinoschisis the activation of Microglia precedes photoreceptor apoptosis. (Gehrig, Langmann et al. 2007) Stap-1 shows highly elevated gene expression levels in activated microglia of RSh1 knock-out mice. Aim of this work was to analyze the promoter of the stap-1 gene, because stap-1 might be an interesting object to better understand microglia activation and possibly influence or limit the activation. A preceding paper of my working group (Weigelt, Moehle et al. 2008) already showed, that the macrophage specific transcription factor PU.1 binds to the stap-1 promoter. In the present work the influence of PU.1 on the activation of stap-1 transcription has been examined. This work shows that the main activity of the promoter lies within -400bp of the starting point of transcription. For the analysis we used three promoter constructs of different length: -1149/-12, -814/-12, -403/-12. Those constructs have been examined concerning activation by using luciferase assays. The luciferase assays have been performed in RAW264.7 cells, macrophage cells and in BV2 cells, microglial cells. Those assays showed, that also the smallest promoter construct leads to full activation. It could also be verified that the identified PU.1 binding site plays an essential role in activation of the stap-1 promoter. The PU.1 binding site in the smallest promoter construct has been mutated. Following that, again luciferase assays have been performed with the mutated and the three wild-type constructs. The activity of the mutated construct was significantly lower than the activity of the wild-type construct. It might be interesting to make those assays with an even smaller construct, which ends right at the PU.1 binding site. Such a construct would start at -110 bp. Also interesting would be to analyse the influence of the second PU.1 binding site. Therefore new constructs would have to be cloned, which go beyond the start of translation. Measurements with such constructs failed in the present work. For such an assay, the end point of the constructs would have to be chosen deliberately. To achieve more detailed knowledge of stap-1 and find out if there might result consequences for therapy, the examination of a stap-1 knock-out mouse would be useful.
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