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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-238200
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 17 April 2012 |
| Referee: | Prof. Dr. Daniela Männel |
| Date of exam: | 13 April 2012 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Immunologie |
| Keywords: | TNF, TNF-Rezeptoren, monoklonale Antikörper, TNFR1, TNFR2, TNF-receptor, antibody |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 23820 |
Abstract (German)
TNF ist ein Zytokin, das sowohl in der lokalen, als auch in der systemischen Entzündungsreaktionen eine ganz zentrale Rolle einnimmt. Es wurde als Mediator zahlreicher inflammatorischer und immunologischer Krankheitsbilder identifiziert und gilt auch in der Infektionsabwehr als einer der wichtigsten Regulatoren der Immunaktivität. Die Entwicklung neuer Therapiestrategien in der Medizin schreitet ...
Abstract (German)
TNF ist ein Zytokin, das sowohl in der lokalen, als auch in der systemischen Entzündungsreaktionen eine ganz zentrale Rolle einnimmt. Es wurde als Mediator zahlreicher inflammatorischer und immunologischer Krankheitsbilder identifiziert und gilt auch in der Infektionsabwehr als einer der wichtigsten Regulatoren der Immunaktivität.
Die Entwicklung neuer Therapiestrategien in der Medizin schreitet in den letzten Jahrzehnten rasant voran. Es zeigte sich dabei zunehmend, dass das Immunsystem eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von Erkrankungen spielt und es daher vor allem im Bereich der Immunregulation weiteren Forschungs- und Entwicklungsbedarf gibt.
Besondere Bedeutung kommt dabei dem immunregulatorischen TNF zu, das als pleiotrop wirkendes Zytokin zahlreiche biologische Funktionen steuert. Die Effekte werden über die Aktivierung zweier membranständiger Rezeptoren, den TNFR1 und den TNFR2 vermittelt. Da eine Dysregulation im TNF-System zu einer Vielzahl entzündlicher und autoimmunologisch- bedingter Krankheiten führen kann und dabei vor allem auch dem TNFR2 eine wichtige pathophysiologische Bedeutung nachgewiesen werden konnte, ist die genaue Erforschung der über diesen Rezeptor vermittelten Signalkaskaden von großem Interesse. Auch im Hinblick auf die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien wäre ein gegen den Maus-TNFR2 gerichteter Antikörper mit agonistischen oder antagonistischer Funktion ein geeignetes molekulares Werkzeug, um die Funktion dieses Rezeptors auch in vivo grundlegend zu erforschen.
Da es derzeit keinen monoklonalen „Maus-anti-Maus“ Antikörper gegen den mTNFR2 gibt war es Ziel dieser Arbeit, in der Maus einen spezifischen Antikörper gegen den mTNFR2 zu entwickeln und seine funktionellen Eigenschaften weiter zu charakterisieren.
Durch die Immunisierung von mTNFR2-/- Mäusen gelang es, mittels Hybridomatechnik den stabil wachsenden Zellklon DJ2008 zu etablieren, der monoklonale Antikörper gegen den mTNFR2 der Subklasse IgG1-κ synthetisierte.
Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass der monoklonale Antikörper im ELISA-, im Dot Blot- und im Western Blot-Verfahren zur Detektion des rekombinant hergestellten mTNFR2-Proteins geeignet war.
Eine Bindung des monoklonalen Antikörpers an den zellständigen mTNFR2 transformierter CHO-Zellen konnte durchflusszytometrisch nicht eindeutig nachgewiesen werden.
Die Bindungsfähigkeit des Antikörpers an den nativen mTNFR2 der T-Zellen aus Milz und Thymus der Maus konnte aufgrund unspezifischer Reaktionen des Sekundärantikörpers mit den stimulierten Mauszellen nicht hinreichend geklärt werden und bedarf weiterer Untersuchungen.
Es konnte jedoch gezeigt werden, dass der monoklonale m-α-mTNFR2-Ak keine kreuzreaktiven Eigenschaften gegenüber den mTNFR1 besaß.
Funktionell zeigte der Antikörper keine aktivierenden Eigenschaften auf die TNFR2-induzierte Proliferationsrate cytotoxischer T-Zellen. Des Weiteren wurden in den durchgeführten Bioassays keine blockierenden Eigenschaften auf den zellständigen mTNFR2 der CT-6 Zelllinie und den löslichen rekombinanten mTNFR2 nachgewiesen.
Insgesamt gelang es in dieser Arbeit erstmals einen monoklonalen Antikörper mit spezifischen Bindungseigenschaften für den mTNFR2 in der Maus herzustellen. Aufgrund seiner Einsetzbarkeit in verschiedenen analytischen Verfahren wie dem ELISA, Dot-Blot und Western Blot, könnte er als molekulares Werkzeug für zahlreiche weiterführende Untersuchungen und Forschungszwecke eingesetzt werden.
Im Hinblick auf seine funktionellen Eigenschaften für den mTNFR2 sind weiterführende Untersuchungen notwendig, um die molekularen Effekte des Antikörpers auf seinen Zielrezeptor genauer zu charakterisieren.
Translation of the abstract (English)
TNF is a cytokine that plays a central role in local reactions, as well as in systemic inflammatory reactions. It was identified as a mediator of many inflammatory and immunological diseases and is one of the most important regulators in the defense of infections. New therapeutic strategies in medicine are rapidly growing in recent decades. It was found that the immune system plays a very ...
Translation of the abstract (English)
TNF is a cytokine that plays a central role in local reactions, as well as in systemic inflammatory reactions. It was identified as a mediator of many inflammatory and immunological diseases and is one of the most important regulators in the defense of infections.
New therapeutic strategies in medicine are rapidly growing in recent decades. It was found that the immune system plays a very important role in a large number of diseases. Therefore, especially in the field of immune regulation, further research and development are absolutely necessary.
Particular importance must be attached to the immunoregulatory TNF, which is a pleiotropic cytokine and controls numerous biological functions. The effects are controlled by the activation of two membrane-bound receptors, the TNFR1 and TNFR2. As a dysregulation in the TNF-system may cause a variety of inflammatory and autoimmune-related diseases, the detailed study, especially of the TNFR2- receptor is of great interest. With regard to the development of new therapeutic strategies, an antibody directed against the mouse- TNFR2 with agonistic or antagonistic function would be a great molecular tool to explore the function of this receptor in vivo.
As there is currently no monoclonal "mouse-anti-mouse” antibody targeting the mTNFR2, it was the aim of this work to develop a specific antibody against this particular receptor and characterize its functional properties.
By immunizing mTNFR2-/ - mice, it was possible to establish a hybridoma cell clone, which was stably synthesizing monoclonal antibody against the mTNFR2 of the subclass IgG1 κ.
It also has been shown, that the monoclonal antibody was able to detect the recombinant mTNFR2-protein in the ELISA- method, the Dot blot method as well as in the Western blot method. Binding of the monoclonal antibody to the membrane-bound mTNFR2 on transformed CHO cells could not be clearly demonstrated in flow cytometry.
The binding ability of the antibody to native splenic T- cells and cells of the thymus could not be clarified sufficiently due to nonspecific reactions of the secondary antibody with the stimulated mouse cells.
However, it was shown that the monoclonal m-α-mTNFR2-Ab has no cross-reactive properties to the mTNFR1.
Furthermore, the antibody showed no activation of the TNFR2-induced proliferation rate on cytotoxic T- cells. There haven’t been any blocking properties been regarding the cell-bound mTNFR2 of the CT-6 cell line or the soluble recombinant mTNFR2.
Overall, this is the first time that a monoclonal antibody with specific binding properties for the mTNFR2 was established in a mouse host. Due to its versatile application options in various analytical techniques such as ELISA, Dot blot and Western blot, the antibody can be used as a molecular tool for many further investigations and research purposes.
Still, further studies are necessary to characterize the molecular effects of the antibody on its target receptor in more detail.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 15:26
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