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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-245783
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 23 May 2013 |
| Referee: | Prof. Dr. Armin Buschauer |
| Date of exam: | 21 May 2012 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | Hyaluronidasen, Hyaluronsäure, Proteinreinigung, Viskosimetrie, Gelektrophorese, S. pneumoniae, hyaluronidase, hyaluronan, protein purification, viscosimetry, gel electrophoresis |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 24578 |
Abstract (English)
Hyaluronan (hyaluronic acid, HA) and its degradation products, generated by hyaluronidases, are known to be involved in cell signaling, cell migration, inflammation and tumor invasion. But the role of hyaluronidases in physiological and pathological processes is relatively unclear, due to insufficient information on enzymatic properties and the lack of specific inhibitors as pharmacological ...
Abstract (English)
Hyaluronan (hyaluronic acid, HA) and its degradation products, generated by hyaluronidases, are known to be involved in cell signaling, cell migration, inflammation and tumor invasion. But the role of hyaluronidases in physiological and pathological processes is relatively unclear, due to insufficient information on enzymatic properties and the lack of specific inhibitors as pharmacological tools. Especially hyaluronidase-2 (Hyal-2) has been a matter of debate with respect to the degradation of hyaluronan. Therefore, the aim of this thesis was to investigate the catalytical Hyal-2 activity of a recombinant human enzyme and in blood cells.
Recombinant human Hyal-2, expressed in DS-2 insect cells, elaborated by Edith Hofinger, was successfully purified to investigate enzymatic activity using two different methods. Viscosimetry was previously shown to be the most sensitive among the classical hyaluronidase assays. The isolated rhHyal-2 proved to be able to degrade hyaluronan within 24 h under acidic conditions (pH = 4.0). Surprisingly, a preference for HA from vertebrate sources (human umbilical cord, rooster comb) over HA of microbial origin was observed. The former was degraded faster and to an apparently higher extent than HA from S. zooepidemicus. By means of polyacrylamide gel electrophoresis followed by a combined alcian blue, silver staining protocol it became possible to estimate the size of the HA fragments generated by the action of rhHyal-2. The results obtained with this method correlated well with data from viscosimetric measurements. HA fragments, formed by the degradation of HA from vertebrate sources (< 15 kDa) were definitely smaller in size than those produced by degradation of HA from S. zooepidemicus (~ 20 kDa).
Inspired by results published by Carol de la Motte et al., human and murine blood platelets were chosen to investigate native Hyal-2. Hyal-2 is the only hyaluronidase present in platelets, with no evidence for other hyaluronidase isoforms. Extensively washed platelets and platelet membrane preparations were analyzed with respect to hyaluronidase activity at different pH values using HA from different sources. Hyaluronan degrading activity could only be detected at acidic pH of 4.0. By analogy with rhHyal-2, HA from vertebrates was the preferred substrate of platelet-associated Hyal-2. In order to unambiguously exclude that, despite extensive washing of the samples, the observed hyaluronidase activity in platelets is due to traces of plasma Hyal-1, platelets from Hyal-2 knock-out (KO) mice were analyzed exactly in the same way as wildtype platelets. Thereby, Hyal-2 activity was definitely proven in platelets, as there was no HA digestion after incubation with KO platelets.
Additionally, red blood cells (RBCs) were investigated. The presence of Hyal-2 and the absence of Hyal-1 were confirmed by Western Blot analysis, and erythrocytes and ghost membrane preparations were analyzed for Hyal-2 activity. Although HA degradation in the presence of RBCs was high, the enzymatic activity resulted from residual plasma Hyal-1. There was no hydrolytic activity upon incubation (72 h) of HA with ghost membrane preparations at any pH tested. The biological relevance of the relatively high expression of Hyal-2 in RBCs, detected immunologically, needs to be further investigated either with regard to the existence of a putative co-receptor or an endogenous inhibitor, associated with Hyal-2 in the RBC membranes.
To gain more insight into the role of HA fragments and to explore, if platelets are capable of generating biologically active HA oligosaccharides, the proliferation of endothelial cells (EC) was examined after addition of HA digests. However, there was no effect on cell proliferation. As there was no evidence for expression of the HA receptor CD44 by these cells, it can be speculated that the presence of functional CD44 is essential for enhanced cell proliferation mediated by binding HA fragments.
Hyaluronidases are also considered virulence factors of microorganism, including several pathogenic strains of Streptococci. Inhibitors of such hyaluronate lyases could serve as pharmacological tools or might be used as adjuvant in the chemotherapy of drug-resistant bacteria. In a screening approach, out of 1352 molecules, obtained from multicomponent synthesis, 4 imidazopyridines were identified as inhibitors of a bacterial lyase (SpnHyl). At an estimated concentration of 200 μM, the most potent compound showed 82 % inhibition of SpnHyl, when incubated with the reaction mixture. In addition, a structurally related conventionally synthesized 2-phenylindole (UR-CT-619), proved to be the most potent inhibitor of SpnHyl known so far.
Translation of the abstract (German)
Hyaluronsäure (Hyaluronan, HA) und deren von Hyaluronidasen erzeugte Abbauprodukte sind beispielsweise als Signalmoleküle an der Zellmigration, an Entzündungsprozessen und an der Tumorinvasion beteiligt. Allerdings ist die Rolle der Hyaluronidasen bei physiologischen und pathologischen Prozessen aufgrund unzureichender Informationen hinsichtlich ihrer enzymatischen Eigenschaften und des Fehlens ...
Translation of the abstract (German)
Hyaluronsäure (Hyaluronan, HA) und deren von Hyaluronidasen erzeugte Abbauprodukte sind beispielsweise als Signalmoleküle an der Zellmigration, an Entzündungsprozessen und an der Tumorinvasion beteiligt. Allerdings ist die Rolle der Hyaluronidasen bei physiologischen und pathologischen Prozessen aufgrund unzureichender Informationen hinsichtlich ihrer enzymatischen Eigenschaften und des Fehlens spezifischer Inhibitoren als pharmakologische Werkzeuge weitgehend unklar. Vor allem die enzymatische Aktivität von Hyaluronidase-2 (Hyal-2) ist Thema einer kontroversen Diskussion in der Literatur. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, die katalytische Aktivität einer rekombinant hergestellten humanen Hyal-2 und des entsprechenden nativen Enzyms in Blutzellen zu untersuchen.
Rekombinante humane Hyal-2 (rhHyal-2) wurde nach einem von Edith Hofinger ausgearbeiteten Verfahren in DS-2 Insektenzellen exprimiert, erfolgreich gereinigt, und die enzymatische Aktivität mit zwei unterschiedlichen Techniken bestimmt. Die Viskosimetrie erwies sich in früheren Untersuchungen als die empfindlichste Methode unter den klassischen Hyaluronidase Assays. Mit dieser Methode gelang es, die enzymatische Aktivität der isolierten rhHyal-2 zu beweisen. Der HA Abbau erfolgte innerhalb von 24 h unter sauren Bedingungen (pH 4,0). Überraschenderweise wurde HA aus Vertebraten (humane Nabelschnur, Hahnenkamm) im Vergleich zu HA bakterieller Herkunft (S. zooepidemicus) bevorzugt, d. h. schneller, umgesetzt. Polyacrylamidgel Elektrophorese mit kombinierter Alcianblau-/Silberfärbung, ermöglichte den Nachweis, die Verteilung und die Größenabschätzung der durch rhHyal-2 generierten HA Fragmente. Die erhaltenen Ergebnisse stimmten mit den Daten aus den viskosimetrischen Bestimmungen überein. HA Fragmente, die durch Abbau von HA aus Wirbeltieren entstanden, waren eindeutig kleiner (< 15 kDa), als jene, welche durch Hydrolyse von HA aus S. zooepidemicus erhalten wurden (~ 20 kDa).
Inspiriert von Ergebnissen von Carol de la Motte et al., wurden humane und murine Thrombozyten als Quelle von nativem Hyal-2, der einzigen Hyaluronidase, welche in Blutplättchen exprimiert wird, ausgewählt. Gründlich gewaschene Thrombozyten und Thrombozytenmembranen wurden bezüglich Hyaluronidase-Aktivität mit HA unterschiedlicher Herkunft als Substrat bei verschiedenen pH-Werten untersucht. Ein Abbau der HA erfolgte lediglich bei pH 4,0. In Analogie zu rhHyal-2 war HA aus Vertebraten das bevorzugte Substrat der Thrombozyten-assoziierten Hyal-2. Um eine Restaktivität der Plasma-Hyal-1 eindeutig ausschließen zu können, wurden Thrombozyten aus Hyal-2 knock-
out (KO) Mäusen mit jenen aus Wildtyp-Mäusen verglichen. Dadurch konnte eindeutig bewiesen werden, dass die in Gegenwart von Thrombozyten gemessene enzymatische Aktivität auf Hyal-2 zurückzuführen ist, da Hyal-2 KO Thrombozyten nicht in der Lage waren, HA abzubauen.
Zusätzlich wurden rote Blutkörperchen (RBC) untersucht. Die An-, bzw. Abwesenheit von Hyal-2, bzw. Hyal-1 wurde über Western Blot Analyse nachgewiesen, und intakte RBC sowie RBC-Membranen wurden hinsichtlich Hyal-2 Aktivität untersucht. Die dabei beobachtete hohe enzymatische Aktivität stellte sich jedoch als Restaktivität der Plasma-Hyal-1 heraus. RBC-Membranen waren selbst nach 72 h Inkubation bei keinem der getesteten pH-Werte in der Lage, HA abzubauen. Ob die relativ hohe Hyal-2 Expression in RBC biologische Relevanz besitzt, muss allerdings noch untersucht werden. Denkbar wäre z. B. die Existenz eines endogenen Inhibitors, der an der Plasmamembran mit Hyal-2 assoziiert ist, oder die Notwendigkeit eines aktivierenden Ko-Rezeptors.
Zur Klärung der Funktion von HA-Oligosacchariden und um zu prüfen, ob in Thrombozyten von Hyal-2 biologisch aktive HA-Fragmente gebildet werden, wurde die Proliferation von humanen Endothelzellen nach Zugabe von HA-Abbauprodukten untersucht. Ein Effekt auf die Zellproliferation wurde nicht beobachtet. Da der HA Rezeptor CD44 mit dem verwendeten Antikörper nicht nachweisbar war, besteht jedoch die Möglichkeit, dass eine funktionelle Expression von CD44 die Voraussetzung für eine durch HA Fragmente ausgelöste erhöhte Zellproliferation ist.
Hyaluronidasen gelten zudem als Virulenzfaktoren von Mikroorganismen, einschließlich einiger pathogener Streptokokken Stämme. Inhibitoren solcher Hyaluronat Lyasen könnten entweder als pharmakologische Werkzeuge dienen oder in der adjuvanten Therapie resistenter Keime zum Einsatz kommen. Deshalb wurden 1352 Substanzen, welche von Christian Textor durch Multikomponentensynthese hergestellt worden waren, auf inhibitorische Aktivität gegenüber einer bakteriellen Lyase (SpnHyl) „gescreent“. Vier Imidazopyridine wurden als Inhibitoren identifiziert, wobei die wirksamste Substanz bei einer Konzentration von 200 μM eine Enzymhemmung von 82 % aufwies. Schließlich wurde mit UR-CT-619, einem strukturell ähnlichen, konventionell synthetisierten 2-Phenylindol, der bisher potenteste Inhibitor von SpnHyl entdeckt.
Metadata last modified: 02 Jun 2018 22:56
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