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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-249575
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.24957
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 21 June 2012 |
| Referee: | PD Dr. Christian Morsczeck and Prof. Dr. Dr. Joachim Grifka |
| Date of exam: | 14 May 2012 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie |
| Keywords: | Differentiation, neuronal, human dental follicle cells |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 24957 |
Abstract (English)
Human dental follicle cells (DFCs) derived from wisdom teeth are precursor cells for cementoblasts. In this study, we recognized that naive DFCs express constitutively the early neural cell marker b-IIItubulin. Interestingly, DFCs formed b-III-tubulin-positive neurosphere-like cell clusters (NLCCs) on lowattachment cell culture dishes in serum-replacement medium (SRM). For a detailed examination ...
Abstract (English)
Human dental follicle cells (DFCs) derived from wisdom teeth are precursor cells for cementoblasts. In this study, we recognized that naive DFCs express constitutively the early neural cell marker b-IIItubulin. Interestingly, DFCs formed b-III-tubulin-positive neurosphere-like cell clusters (NLCCs) on lowattachment cell culture dishes in serum-replacement medium (SRM). For a detailed examination of the neural differentiation potential, DFCs were cultivated in different compositions of SRM containing supplements such as N2, B27, G5 and the neural stem cell supplement. Moreover, these cell culture
media were combined with different cell culture substrates such as gelatin, laminin, poly-L-ornithine or poly-L-lysine. After cultivation in SRM, DFCs differentiated into cells with small cell bodies and long cellular extrusions. The expression of nestin, b-III-tubulin, neuron-specific enolase (NSE) and neurofilament was up-regulated in SRM supplemented with G5, a cell culture supplement for glial cells, and the neural stem cell supplement. DFCs formed NLCCs and demonstrated an increased gene expression of neural cell markers b-III-tubulin, NSE, nestin and for small neuron markers such as neuropeptides galanin (GAL) and tachykinin (TAC1) after cultivation on poly-L-lysine. For a further neural differentiation NLCC-derived cells were sub-cultivated on laminin and poly-L-ornithine cell culture substrate. After 2 weeks of differentiation, DFCs exposed neural-like cell morphology with small neurite-like cell extrusions. These cells differentially express neurofilament and NSE, but only low levels of b-III-tubulin and nestin. In conclusion, we demonstrated the differentiation of human DFCs into neuron-like cells after a two-step strategy for neuronal differentiation.
Translation of the abstract (German)
In der modernen Medizin ist der Einsatz von Stammzellen zunehmend unverzichtbar. So ermöglicht das Tissue Engineering durch die Kombination autolog gewonnener Zellen und biokompatibler Trägermaterialien heute bereits die Herstellung künstlicher Gewebe. Diese können als zur Unterstützung oder Substitution von degenerierten Geweben oder Organen in den Patienten replantiert werden. Dentale ...
Translation of the abstract (German)
In der modernen Medizin ist der Einsatz von Stammzellen zunehmend unverzichtbar. So ermöglicht das Tissue Engineering durch die Kombination autolog gewonnener Zellen und biokompatibler Trägermaterialien heute bereits die Herstellung künstlicher Gewebe. Diese können als zur Unterstützung oder Substitution von degenerierten Geweben oder Organen in den Patienten replantiert werden. Dentale Follikelzellen (dental follicle cells, DFCs) stellen hierzu eine leicht zugängliche Stammzellquelle dar. Es handelt sich um adulte Stammzellen, die aus dem Zahnsäckchen von Weisheitszähnen ohne abgeschlossenes Wurzelwachstum gewonnen werden können und ektomesenchymalen Ursprungs sind. Unter in-vitro-Bedingungen sind DFCs plastikadhärent und besitzen klonogene Eigenschaften. Sie konnten bereits zu Osteoblasten, Chondrozyten und Adipozyten, sowie in Zementoblasten und parodontale Ligamentzellen differenziert werden. DFCs exprimieren mesenchymale Stammzellenmarker wie zum Beispiel STRO-1, ein Marker für multipotente Stammzellen, aber auch neuronale Progenitorzellmarker wie Notch-1 und Nestin. Dies lässt auf ihre Herkunft von Zellen aus der Neuralleiste schließen, aus der auch das periphere Nervensystem entsteht. Allerdings konnte bislang nicht gezeigt werden, ob humane DFCs in neurale Zellen differenziert werden können.
Ziel dieser Arbeit war es, das neuronale Differenzierungspotential der humanen dentalen Follikelzellen zu untersuchen. Hierzu wurden die DFCs in einem ersten Schritt in drei verschiedenen serumfreien, neuronalen Differenzierungsmedien (neuronal stem cell media, NSCM I-III) auf unterschiedlich beschichteten Zellkulturoberflächen (Polystyrol, Gelatine, Ornithin oder Laminin) kultiviert. Nach einer Kultivierungszeit von 7-14 Tagen wurden die Zellen lichtmikroskopisch und mittels quantitativer realtime RT-PCR charakterisiert. Interessanterweise lösten sich die DFCs auf den mit Poly-L-Lysin und L-Ornithin beschichteten Oberflächen in Kombination mit den unterschiedlichen Differenzierungsmedien von der Oberfläche ab und bildeten im Medium schwimmende Zellkonglomerate (neurosphere like cell cluster, NLCC). Es ist bekannt, dass neurospheres, die aus Zellen des zentralen Nervensystem gewonnen werden, ein besonders hohes neuronales Differenzierungspotential besitzen. In der quantitativen realtime RT-PCR zeigten die NLCCs der DFCs besonders auf Poly-L-Lysin und dem NSCM I (Neurobasalmedium mit G5 supplement) einen Anstieg der Genexpression sowohl des neuralen Progenitorzellenmarkers Nestin (NES), als auch des neuronalen Zellmarkers ÿ-III-Tubulin (TUBB3). ÿ-III Tubulin zählt zu den neuronenspezifischen Markern und ist in frühen Stadien der neuronalen Differenzierung zu finden. Marker von späten Stadien, wie zum Beispiel das Neurofilament, die neuronenspezifischen Enolase (NSE) oder das „Mikrotubuli assoziierten Protein 2“ (MAP 2) zeigten einen nur schwachen Anstieg der Expression gegenüber undifferenzierten Follikelzellen.
Zur weiteren neuronalen Differenzierung wurden die NLCCs der Paarung Poly-L-Lysin und dem NSCM I (Neurobasalmedium mit G5 supplement) isoliert, separiert und auf einer Laminin/Poly-L-Ornithin-modifizierten Oberfläche und einem weiteren Differenzierungsmedium (DMEM/F12 mit Insulin–transferrin–sodium selenite supplement und FGF-2) für weitere 14 Tage kultiviert. Die erhaltenen Zellen waren plastikadhärent und zeigten unter dem Lichtmikroskop eine Nervenzell-ähnliche Morphologie mit einem kleinen Zellkörper und langen Zellausläufern. In der quantitativen realtime RT-PCR Untersuchung und in der immunzytochemischen Untersuchung exprimierten diese Zellen neben Neurofilament vor allem NSE, also Marker der späten neuronalen Differenzierung. Die Marker der frühen Stadien einer neuronalen Differenzierung wie Nestin und ÿ-III-Tubulin hingegen wurden stark herunterreguliert.
In einer Subpopulationsanalyse zur Spezifizierung der differnzierten Zellen zeigte sich ein differentieller Anstieg der Expression für die Neuropeptide Tachykinin (TAC 1) und Galanin. Tachykinin ist die Vorstufe zu der Substanz P und dient als Neurotransmitter zwischen peripheren Nervenzellen und der glatten Muskulatur. Interessanterweise wurde es auch bei neuronal differenzierten mesenchymalen Zellen gefunden. Galanin ist ebenfalls ein Peptid, welches in vielen unterschiedlichen Neuronen exprimiert wird und unter anderem die Neurogenese initiiert. Marker dopaminerger, serotonerger oder GABAminerger Neuronen konnten nicht nachgewiesen werden.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit ein neuronales Differenzierungspotential humaner dentaler Follikelzellen mittels einer Zwei-Schritt-Strategie nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass sich in einem ersten Schritt aus naÿven DFCs durch eine Modifikation der Oberfläche und des Mediums neurosphere like cluster bilden und Marker früher Stadien der neuronalen Differenzierung exprimieren. Weiter konnte gezeigt werden, dass sich aus diesen NLCCs nach einem weiteren Differenzierungsschritt Neuronen-ähnliche Zellen bilden, die späte neuronale Marker wie NSE und Neurofilament exprimieren. DFCs haben ein neuronales Potential und stellen somit eine vielversprechende Quelle für neue Therapieformen dar.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 04:36
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