| License: Publishing license for publications excluding print on demand (3MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-254938
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.25493
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | July 2013 |
| Referee: | Prof. Dr. Gernot Längst and Prof. Dr. Klaus Grasser |
| Date of exam: | 20 July 2012 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III > Prof. Dr. Gernot Längst |
| Keywords: | Chromatin, Histonvarianten, Bäckerhefe |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 25493 |
Abstract (English)
The histone variant H2A.Z exhibits specialized functions in a large number of organisms. It is generally found to be enriched in heterochromatic regions as well as at the promoters of most genes. The effects of differential expression during the cell cycle, an outstanding distinction between canonical and variant histones have so far not been examined. This study addressed the question whether ...
Abstract (English)
The histone variant H2A.Z exhibits specialized functions in a large number of organisms. It is generally found to be enriched in heterochromatic regions as well as at the promoters of most genes. The effects of differential expression during the cell cycle, an outstanding distinction between canonical and variant histones have so far not been examined. This study addressed the question whether S-phase coupled vs. constitutive expression can explain the observed incorporation patterns characteristic of H2A.Z. A second part of this work dealt with specific nucleosome positions occupied by variant nucleosomes.
Analyses of histone deposition via Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) showed that the characteristic enrichment of H2A.Z containing nucleosomes at promoters is dependent on the constitutive expression of the histone variant. Deposition patterns similar to H2A.Z were observed with canonical histones when they were expressed under the control of the H2A.Z promoter. In contrast, results showed that the SWR complex is not responsible for targeting H2A.Z to promoters. So far the SWR complex had been regarded as the only determinant for the establishment of H2A.Z deposition patterns. ChIP analyses showed that the increased promoter occupancy of H2A.Z containing nucleosomes depends on transcription rates of a given gene. These findings led to the proposal of a model wherein H2A.Z gets incorporated into chromatin via untargeted replacement of H2A-H2B dimers with H2A.Z-H2B dimers across the genome in a Swr1p dependent manner. During transcriptional elongation, nucleosomes over coding regions are subsequently depleted of H2A.Z, which results in the higher H2A.Z density observed at promoters.
In addition to a predominant incorporation of the histone variant at certain loci, the specific positioning of variant containing nucleosomes might affect chromatin structure. In vitro analyses of nucleosome positioning in the presence of the histone variants H2A.Z and H3.3 showed that the incorporation of H2A.Z into recombinant histone octamers resulted in altered nucleosome positioning on short linear DNA fragments. Presence of H3.3 did not affect positioning and could not alter H2A.Z mediated positioning differences. For the first time ATP-dependent nucleosome remodeling machines could be shown to respond differently to canonical and variant nucleosome templates in vitro, suggesting they have the ability to read the histone content of nucleosomes in addition to the underlying DNA. Next, histone variant positioning was addressed in vivo using the ChEC method. ChEC experiments proofed to be a viable tool to study in vivo nucleosome positions; differences in MNase cutting events mediated by H2A- or H2A.Z-MNase fusion proteins were observed at different genomic locations. Additional ChEC analysis revealed that the INO80 complex plays a role in the specific positioning of promoter nucleosomes, visualizing for the first time the in vivo effect of a chromatin remodeling complex on single nucleosomes.
A third part of the presented thesis investigated the role of the unique C-terminal tail of canonical histone H2A. In vitro experiments showed that C-terminal truncation mutants exhibited increased nucleosome mobility in thermal mobilization experiments. Chromatin remodeling by ISWI type chromatin remodeling enzymes was impaired with nucleosomes containing C-terminally truncated H2A mutants. Furthermore, it could be shown that the C-terminal tail of H2A acts as a recognition and binding site for linker histone H1. The results led to the conclusion that the H2A C-terminal tail has a bipartite function: it stabilizes the nucleosome core particle and mediates protein interactions that control chromatin dynamics and conformation.
Translation of the abstract (German)
Die Histonvariante H2A.Z erfüllt verschiedene Funktionen in einer Vielzahl von Organismen. Sie ist generell im Heterochromatin und an den Promotoren der meisten Gene angereichert. Die Effekte der differentiellen Expression während des Zellzyklus – ein herausragender Unterschied zwischen kanonischen und varianten Histonen – wurden bisher nicht untersucht. Diese Arbeit beschäftigte sich mit der ...
Translation of the abstract (German)
Die Histonvariante H2A.Z erfüllt verschiedene Funktionen in einer Vielzahl von Organismen. Sie ist generell im Heterochromatin und an den Promotoren der meisten Gene angereichert. Die Effekte der differentiellen Expression während des Zellzyklus – ein herausragender Unterschied zwischen kanonischen und varianten Histonen – wurden bisher nicht untersucht. Diese Arbeit beschäftigte sich mit der Frage, ob S-Phase gekoppelte im Gegensatz zur konstitutiven Expression die beobachteten, für H2A.Z charakteristischen Einbaumuster erklären kann.
Die Analyse des Histoneinbaus mittels Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) zeigte, dass die charakteristische Anreicherung von H2A.Z-enthaltenden Nukleosomen an Promotoren von der konstitutiven Expression der Histonvariante abhängt. H2A.Z-ähnliche Einbaumuster wurden bei kanonischen Histonen beobachtet, wenn diese unter Kontrolle des H2A.Z-Promotors exprimiert wurden. Im Gegensatz dazu zeigten die Ergebnisse, dass der SWR-Komplex nicht für den zielgerichteten Einbau von H2A.Z verantwortlich ist. Bisher wurde der SWR-Komplex für die einzige Determinante gehalten, die die typischen H2A.Z Einbaumuster verursacht.
ChIP-Analysen zeigten, dass die erhöhte Promotor-Okkupanz von H2A.Z-enthaltenden Nukleosomen von der Transkriptionsrate des untersuchten Gens abhängt. Diese Befunde führten zum Vorschlag eines Modells in welchem H2A.Z mittels nicht-zielgerichteten Austauschs von H2A-H2B Dimeren gegen H2A.Z-H2B Dimere in Swr1p abhängigen Reaktionen ins Chromatin eingebaut wird. Während der Transkriptions-Elongation wird H2A.Z aus Nukleosomen in der kodierenden Region depletiert, was zur höheren H2A.Z Dichte an Promotoren führt.
Zusätzlich zum bevorzugten Einbau der Histonvariante H2A.Z an bestimmten genomischen Loci ist es möglich, dass die spezifische Positionierung von varianten Nukleosomen die Chromatinstruktur beinflusst.
In vitro Analysen der Nukleosomen-Positionierung in Anwesenheit von H2A.Z und H3.3 zeigten, dass der Einbau von H2A.Z in rekombinante Histonoktamere zu veränderter Nukleosomen-Positionierung auf kurzen linearen DANN-Fragmenten führte. Die Anwesenheit von H3.3 beeinflusste die Positionierung nicht und konnte die H2A.Z vermittelten Positionsunterschiede nicht verändern. Es wurde zum ersten Mal gezeigt, dass Remodeling-Maschinen in vitro unterschiedlich auf kanonische und variante Nukleosomen reagieren, was darauf schließen lässt, dass sie den Histoninhalt von Nukleosomen zusätzlich zur nukleosomalen DNA interpretieren können.
In vivo wurde die Positionierung von H2A.Z mit Hilfe der ChEC Methode untersucht. ChEC-Experimente stellten sich als geeignet dar, um die in vivo Positionierung von Nukleosomen zu untersuchen. Unterschiede im MNase Schnittmuster, das von H2A-MNase oder H2A.Z-MNase Fusionsproteinen erzeugt wurde, wurden in verschiedenen genomischen Regionen beobachtet. Zusätzliche ChEC-Experimente zeigten, dass der INO80-Komplex eine Rolle bei der spezifischen Positionierung von Promotor-Nukleosomen spielt. Dies zeigte zum ersten Mal in vivo den Effekt eines Remodeling-Komplexes auf einzelne Nukleosomen.
Ein dritter Teil der vorgestellten Dissertation untersuchte die Rolle des einzigartigen C-Terminus von kanonischem H2A. In vitro Experimente zeigten für C-terminale Deletionsmutanten erhöhte Nukleosomen-Mobilität bei thermischer Nukleosomen-Mobilisierung. Chromatin-Remodeling mit ISWI-Remodelern wurde durch die Nukleosomen mit C-terminal verkürzten H2A-Mutanten behindert. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der C-Terminus von H2A als Erkennungs- und Bindestelle für linker-Histon H1 wirkt. Die Resultate führten zu dem Schluss, dass der H2A C-Terminus eine zweigeteilte Funktion erfüllt: er stabilisiert das Nukleosom und vermittelt Protein-Wechselwirkungen, die die Chromatindynamik und –konformation kontrollieren.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 04:19
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