| License: Publishing license for publications excluding print on demand (3MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-258899
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.25889
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 19 September 2012 |
| Referee: | Prof. Dr. Stefan Fichtner-Feigl |
| Date of exam: | 12 September 2012 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Chirurgie |
| Keywords: | TLR, Toll- like Rezeptor, Interleukin- 13, IL- 13, Signalweg, toll- like receptor, signaling pathway |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 25889 |
Abstract (German)
Der Begriff der Entzündung stellt eine komplexe Antwort auf Konditionen der homöostatischen Imbalance dar. Toll- like Rezeptoren (TLRs) sind die bekanntesten und meist untersuchten Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, welche für den Beginn einer Entzündungsreaktion verantwortlich sind. TLRs erkennen spezifisch Muster etwaiger in den Wirt eindringender Pathogene aber auch kommensaler ...
Abstract (German)
Der Begriff der Entzündung stellt eine komplexe Antwort auf Konditionen der homöostatischen Imbalance dar. Toll- like Rezeptoren (TLRs) sind die bekanntesten und meist untersuchten Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, welche für den Beginn einer Entzündungsreaktion verantwortlich sind. TLRs erkennen spezifisch Muster etwaiger in den Wirt eindringender Pathogene aber auch kommensaler Strukturen, dienen somit als Sensoren der angeborenen Immunität und setzen in einer für den jeweiligen TLR spezifischen Kaskade einen Signalweg in Gang, an dessen Ende die Regulation von Transkriptionsfaktoren und schließlich die Expression proinflammatorischer Gene bzw. Zytokine steht.
Kommt es im Rahmen von Autoimmun-, Infektions- oder chronisch- entzündlicher Erkrankungen zu ungeordneten, nicht- regulierten Entzündungsreaktionen, spielen TLRs eine erhebliche Rolle, zumal regulatorische Mechanismen der Entzündung, welche nach unserem Verständnis vor allem auf die Kontrolle des TLR- Signalweges limitiert sind, einer engmaschigen, negativen Kontrolle bedürfen, um so überschießende Immunreaktionen zu vermeiden.
Mit dem Ziel als negativer Kontrollmechanismus die regulierte Aktivierung des TLR- Signalweges sicherszustellen bzw. eine überschießende Aktivierung zu unterdrücken, soll in dieser Arbeit untersucht werden, welchen Einfluss das TH2- Zytokin IL- 13 auf die Expression, Signaltransduktion bzw. die konsekutive Zytokinproduktion des TLR2 und TLR4 hat.
T- Zellen, als Effektorzellen der adaptiven Immunantwort, stellen die Grundvoraussetzung dar, Pathogene wirksam zu bekämpfen. Die Aktivierung und Differenzierung naiver CD4+ T- Zellen erfolgt TLR- vermittelt, zumal jene auf antigenpräsentierenden Zellen zu vermehrter Oberflächenexpression kostimulatorischer Moleküle (z.B. CD80/86) sowie zur Ausschüttung TH1- bzw. TH2- spezifischer Zytokine führen und so als verbindendes Element zwischen angeborener und adaptiver Immunantwort fungieren. Um den entscheidenden Charakter der TLR- induzierten Zytokine bei der Differenzierung naiver T- Zellen zu veranschaulichen und um IL- 13 als TH2- Zytokin zu charakterisieren, wurde mittels intrazellulärer FACS- Analyse nach entsprechendem TH1-/TH2- Priming die Differenzierung naiver CD4+ Splenozyten in IFNγ- produzierenden TH1- Zellen und IL- 13 produzierenden TH2- Zellen dargestellt. Zudem konnte hierbei der postulierte TH2- Charakter von IL- 25 deutlich aufgezeigt werden. Um die Auswirkung von IL- 13 auf die Expression der kostimulatorischen Moleküle CD80/CD86 zu untersuchen, wurden J774- Zellen mit TLR- spezifischen Liganden (PGN, LPS, PGN+ LPS) stimuliert, die konsekutive oberflächliche Mehrexpression von CD80 konnte durch IL- 13 in allen Stimulationen reduziert werden, wohingegen IL- 13 auf die oberflächliche Expression von CD86 keinen Effekt hatte.
Das proinflammatorische, heterodimere Zytokin IL- 12 hat bedeutende Funktionen sowohl im Bereich der Induktion als auch der Aufrechterhaltung einer zellulären TH1 – Immunantwort und steht nach Aktivierung der TLRs als Produkt am Ende des Toll- like Rezeptorsignalweges. Mittels ELISA wurde die IL- 12 Produktion der mit TLR- spezifischen Liganden stimulierten Zellen (J774- Zellen, Knochenmarkszellen, Splenozyten) vermessen und mit derjenigen nach zusätzlicher Stimulation mittels IL- 13 verglichen: In allen Stimulationen konnte nach zusätzlicher Stimulation eine deutliche Reduktion des proinflammatorischen Zytokins IL- 12 gezeigt werden. Interessanterweise hatte IL- 13 auf die Produktion des antiinflammatorischen Zytokins IL- 10 keinen nennenswerten Einfluss.
Um die unmittelbare Auswirkung von IL- 13 auf die Oberflächenexpression des TLR2 bzw. TLR4 zu bestimmen, wurden Zellen mit TLR- spezifischen Liganden stimuliert, jeweils zusätzlich mit IL- 13 versetzt und die TLR2-/ TLR4- Expression mittels FACS- Analyse bestimmt. Während IL- 13 keinen Einfluss auf die oberflächliche Expression von Primärzellen hatte, konnte hinsichtlich der TLR2- Oberflächenexpession infolge IL- 13 Stimulation eine deutliche Reduktion bei unstimulierten J774- Zellen, kein Effekt jedoch bei stimulierten Zellen detektiert werden, wohingegen umgekehrt, die oberflächliche TLR4- Expression betreffend, keine Reduktion bei den unstimulierten, jedoch ein deutlich reduzierender Effekt bei den stimulierten Zellen aufgezeigt werden konnte.
Per PCR- Analyse wurde im Anschluss die Auswirkung von IL- 13 auf die Expression von TLR2/ TLR4 auf mRNA- Ebene untersucht. Während die TLR4 mRNA- Expression infolge des Phänomens der Endotoxin- Toleranz nach Stimulation mit den entsprechenden TLR- spezifischen Liganden nicht über das Level der unstimulierten Zellen anstieg, reduzierte IL- 13 deutlich die TLR2 mRNA- Expression aller stimulierten J774- Zellen.
Zumal CD14 eine unabdingbare Voraussetzung zur Aktivierung des MyD88- unabhängigen TLR4- Signalweges darstellt und zudem durch die Steigerung der Sensitivität dieses Rezeptorkomplexes für seinen Liganden LPS eine entscheidende Funktion in der Aktivierung des TLR4- MD2 Komplexes innehat, konnte im Folgenden gezeigt werden, dass IL- 13 die mRNA- Expression von CD14 sowohl in unstimulierten Zellen als auch in LPS- stimulierten Zellen, nicht jedoch in PGN- stimulierten Zellen deutlich dezimiert.
Um die Auswirkung von IL- 13 im Toll- like Rezeptorsignalweg auf der Ebene der Transkription näher zu betrachten, wurde im Anschluss die Bindungsaktivität der Transkriptionsfaktoren NF- κB und CREB nach 30 min und 120 min, jeweils nach Stimulation mit PGN bzw. PGN+ IL- 13, untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass IL- 13 nach 30 min die Bindungsaktivität beider Transkriptionsfaktoren herabsetzt, während nach 120 min lediglich die Bindungsaktivität von NF- κB reduziert zur Darstellung kam.
Das TH2- Zytokin IL-13 hat demnach zusammenfassend sowohl auf die Expression, die Signaltransduktion sowie die konsekutive Zytokinproduktion des TLR2 und TLR4 einen negativen Effekt
Translation of the abstract (English)
Inflammation illustrates a complex set of interactions in terms of homeostatic imbalance. Toll- like receptors (TLRs) are most common and most investigated receptors of innate immunity being the first line of defense against microbial pathogens. TLRs specifically recognize patterns and commensal structures of host- invading microbial pathogens, therefore serve as sensors of innate immunity ...
Translation of the abstract (English)
Inflammation illustrates a complex set of interactions in terms of homeostatic imbalance.
Toll- like receptors (TLRs) are most common and most investigated receptors of innate immunity being the first line of defense against microbial pathogens.
TLRs specifically recognize patterns and commensal structures of host- invading microbial pathogens, therefore serve as sensors of innate immunity and
initiate, by using TLR- specific cascades, a signaling pathway resulting in regulation of transcription factors and expression of pro- inflammatory genes and cytokines, respectively.
Since, to the best of our knowledge, regulatory mechanisms of inflammation mainly are limited to the monitoring of the TLR signaling pathway, TLRs play an instructive role in the context of autoimmune-, infectious- or chronic inflammatory diseases, which may result in disordered inflammatory response. The aim of this study is to investigate the influence of the TH2- cytokine IL- 13 on TLR2 and TLR4 regarding receptor- expression, signal transduction and consecutive production of cytokines, in order to ensure regulated activation and eliminate excessive disorder of the TLR signaling pathway, respectively.
T- cells are effector cells of acquired immunity constituting a prerequisite to effectively defend itself against microbial pathogens.
As TLR- activation results in both increased surface expression of co- stimulatory molecules (e.g. CD80/86) and augmented production of TH1- and TH2- specific cytokines, activation and differentiation of naive CD4+ T- cells occurs TLR- mediated, therefore being a connecting element between innate and acquired immunity.
In order to illustrate both the crucial character of TLR- mediated cytokines in terms of differentiation of naive T- cells and characterize IL- 13 as a TH2 member cytokine, differentiation of naive CD4+ splenocytes in IFNγ producing TH1 cells and IL- 13 producing TH2 cells was shown by performing intracellular FACS- analysis coming along with previous TH1/TH2 priming. Postulated TH2 -character of IL- 25 could be shown. J774 cells were stimulated with TLR- specific ligands (PGN, LPS, PGN+ LPS) in order to investigate the effect of IL- 13 on expression of co- stimulatory cytokines: whereas IL- 13 had no effect on surface expression of CD86, due to IL- 13 administration reduction of increased surface expression of CD80 could be shown in all stimulated sets.
IL- 12 is a pro- inflammatory, heterodimeric cytokine being a product at the end of the TLR signaling pathway and shows crucial functions in both induction and maintenance of cellular TH1 immune response. ELISA was performed and IL- 12 production of cells (J774- cells, bone marrow cells, splenocytes), which previously have been stimulated with TLR- specific ligands, was measured and compared with IL- 12 production after additional administration of IL- 13 in correspondent sets: additional stimulation with IL- 13 showed reduced IL- 12 production in all stimulated sets. Interestingly IL- 13 had no particular influence on anti- inflammatory IL- 10.
In order to determine the effect of IL- 13 on cell surface expression of TLR2/TLR4, cells were stimulated with TLR- specific ligands, consecutive in each set additional IL- 13 was added and FACS- analysis was performed: IL- 13 had no additional value on TLR surface expression of primary cells. However, in reference to TLR2 surface expression due to IL- 13 administration, TLR surface expression in unstimulated J774 cells was significantly reduced and no effect in stimulated cells could be detected. Vice versa, in reference to TLR4 cell surface expression due to IL- 13 administration, no reducing effect in unstimulated, however, significant lower expression in stimulated cells could be shown.
PCR analysis was performed to determine implication of IL- 13 on TLR2/TLR4 mRNA- expression. Based on endotoxin tolerance, TLR4 mRNA- expression after stimulation with TLR specific ligands was diminished compared to unstimulated cells, however, significantly reduced TLR2 mRNA- expression due to additional IL- 13 could be shown in all stimulated sets.
CD14 is an indispensable requirement both to activate MyD88- independent TLR4 pathway and to activate TLR4- MD2 complex by increasing sensivity for LPS. Diminished CD14 mRNA- expression in unstimulated and LPS- stimulated cells could be shown after administration of IL- 13, however, referring to this, PGN- stimulated cells showed no effect.
To characterize the effect of IL- 13 on the TLR signaling pathway in terms of transcription, binding activity of transcription factor NF- қB and CREB was determined 30 min and 120 min after administration of PGN. Additional administration of IL -13 reduced binding activity of both transcription factors in the set after 30 min, however, after 120 min merely binding activity of NF- қB was diminished.
In conclusion, IL- 13 shows reducing effects on TLR2 and TLR4 regarding receptor- expression, signal transduction and consecutive cytokine production.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 04:04
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