| License: Publishing license for publications excluding print on demand (6MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-265245
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.26524
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 22 October 2012 |
| Referee: | Prof. Dr. Karl Kunzelmann |
| Date of exam: | 16 October 2012 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Physiologie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Physiologie > Prof. Dr. Karl Kunzelmann |
| Keywords: | Anoctamins, CaCC, calmodulin |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 26524 |
Abstract (English)
Anoctamins are a family of Ca2+ activated Cl- channels (CaCCs) that are ubiquitously expressed in almost every cell type in our body. Anoctamins play an essential role in volume regulation, epithelial Cl- secretion, neuronal excitability, and also nociception. Mutations in anoctamin proteins lead to various diseases including bone and muscle dystrophy, cerebellar ataxias, and blood coagulation ...
Abstract (English)
Anoctamins are a family of Ca2+ activated Cl- channels (CaCCs) that are ubiquitously expressed in almost every cell type in our body. Anoctamins play an essential role in volume regulation, epithelial Cl- secretion, neuronal excitability, and also nociception. Mutations in anoctamin proteins lead to various diseases including bone and muscle dystrophy, cerebellar ataxias, and blood coagulation defect. More importantly, up-regulation of anoctamins is highly linked to different types of cancers. This family of proteins were identified 2004 but their precise function is still under examination. In the following chapters I investigated how these channels are regulated, to get a better understanding of how they function as CaCC. I demonstrate that i) anoctamins are a family of CaCCs, ii) they produce volume-regulated chloride currents, iii) activation of Ano1 occurs in a calmodulin-dependent way, and iv) INO-4995 and other inositolphosphates control Ano1.
Anoctamins are a family of Ca2+ activated Cl- channels
Ano1 and 2 are reported to be CaCCs, Ano6 operates as an essential component of the outwardly rectifying chloride channel (ORCC), while others were reported as intracellular proteins. It is therefore unclear whether anoctamins constitute a family of CaCCs, or reflect proteins with heterogeneous functions. Using whole cell patch clamping we demonstrate that Ano4-10 are able to produce transient Ca2+ activated Cl- currents, when expressed in HEK293 cells. While some anoctamins (Ano1,2,4,6,7) were found to be well expressed in the plasma membrane, others (Ano8,9,10) show rather poor membrane expression and are mostly retained in the cytosol. The transient nature of the Cl- currents produced by Ano1 may be due to deactivation occurring via a calmodulin-dependent kinase. The present results demonstrate that anoctamins are a family of CaCCs, which also induce permeability for cations. They are located in the plasma membrane or in intracellular compartments. Our results will support understanding of the physiological significance of anoctamins and their role in disease.
Anoctamin proteins produce volume-regulated chloride currents
All vertebrate cells can regulate their volume through activating chloride channels during regulatory volume decrease. Ano1 and other anoctamins function as CaCC. They play a role during cell swelling and are activated by an autocrine mechanism that involves ATP release and binding to purinergic P2Y2 receptors. A Ca2+ independent mechanism which engages extracellular-regulated protein kinases (ERK1/2) is also an important step during Ano1 activation induced by cell swelling. Swelling activated Cl- currents are abolished in the colonic epithelium and in salivary acinar cells in Ano1 knockout mice. Thus, amoctamin proteins constitute a crucial component of epithelial volume-regulated Cl- channels and may also have a function during cellular proliferation and apoptotic cell death.
Calmodulin-dependent activation of Ano1
Ano1 is activated upon an increase in intracellular Ca2+ concentration, but it is unclear whether Ca2+ binds directly to the channel or whether additional components are required. We demonstrate that Ano1 is strictly plasma membrane localized and requires cytoskeletal interactions to be fully activated. Despite the need for cytosolic ATP for full activation, phosphorylation by protein kinases is not required. In contrast, the Ca2+ binding protein calmodulin appears indispensable and interacts physically with Ano1. Openers of small- and intermediate-conductance Ca2+ -activated potassium channels known to interact with calmodulin also activated Ano1. These results reinforce the use of these compounds for activation of electrolyte secretion in diseases such as cystic fibrosis (CF).
Control of Ano1 by INO-4995 and other inositolphosphates
Earlier studies suggested CaCCs are regulated by membrane lipid inositol phosphates, and augmented by 1-O-octyl-2-O-butyryl-myo-inositol 3,4,5,6-tetrakisphosphate octakis (propionoxymethyl) ester (INO-4995). Here we examined whether Ano1 is a target of INO-4995, and if the channel is regulated by inositol phosphates. We found that INO-4995 directly activates Ano1 in Ano1 over expressing cells. The tetrakisphosphates Ins(3,4,5,6)P4 or Ins(1,3,4,5)P4 and enzymes controlling levels of InsP4 or PIP2 and PIP3 had no effects on the magnitude or kinetics of Ano1 currents. In contrast in Xenopus oocytes, human airways and colonic epithelial cells, which endogenously express Ano1, Cl- currents were not acutely activated by INO-4995. However incubation with INO-4995 augmented Ano1-dependent currents activated by ionomycin or ATP in Xenopus oocytes and human airways epithelial cells, while intracellular Ca2+ signals were not affected. Our data indicate that Ano1 is the target for INO-4995, although the mode of action appears different for over-expressed and endogenous channels. INO-4995 may be useful for the treatment of CF lung disease.
Translation of the abstract (German)
Anoctamine sind eine Familie von Ca2+ aktivierten Cl- Kanälen (CaCCs), die ubiquitär in den meisten Zellen des Körpers exprimiert werden. Anoctamine spielen eine essentielle Rolle für die Volumenregulation, epitheliale Sekretion, neuronale Erregbarkeit und auch für die Nozizeption. Mutationen der Anoctamin-Proteine führen zu verschiedenen Erkrankungen wie Knochen- und Muskeldystrophie, zerebrale ...
Translation of the abstract (German)
Anoctamine sind eine Familie von Ca2+ aktivierten Cl- Kanälen (CaCCs), die ubiquitär in den meisten Zellen des Körpers exprimiert werden. Anoctamine spielen eine essentielle Rolle für die Volumenregulation, epitheliale Sekretion, neuronale Erregbarkeit und auch für die Nozizeption. Mutationen der Anoctamin-Proteine führen zu verschiedenen Erkrankungen wie Knochen- und Muskeldystrophie, zerebrale Ataxie und zu Defekten der Blutstillung. Darüber hinaus ist eine erhöhte Expression von Anoctaminen mit verschiedenen Krebsarten verbunden. Die Proteinfamilie wurde 2004 identifiziert, aber bis heute ist die exakte Funktion dieser Proteine unbekannt. In den folgenden Kapiteln untersuchten wir wie diese Kanäle reguliert werden, um ein besseres Verständnis über deren Funktion als CaCC zu bekommen: Anoctamine sind eine Familie von CaCCs, sie produzieren einen volumenregulierten Chloridstrom, Aktivierung von Ano1 ist von Calmodulin abhängig und schließlich kontrollieren INO-4995 und andere Inositolphosphate Ano1.
Anoctamine sind eine Familie von Ca2+ aktivierten Cl- Kanälen
Ano1 und 2 sind als CaCCs beschrieben worden. Ano6 ist eine wichtige Komponente des auswärtsgleichgerichteten Chloridkanals (ORCC), während die anderen Anocatmine als intrazelluläre Proteine vorliegen. Es ist deswegen unklar, ob die Anoctamine eine Familie von CaCCs bilden, oder ob sie Proteine mit unterschiedlichen Funktionen darstellen. Mittels der Patch- Clamp- Technik in der Ganzzell-Konfiguration konnten wir zeigen, dass Ano4-10 in der Lage sind transiente Ca2+ aktivierte Cl- Ströme zu produzieren, wenn sie in HEK293 Zellen exprimiert werden. Während manche Anoctamine (Ano1, 2, 4, 6, 7) in der Plasmamembran exprimiert werden, zeigen andere (Ano8, 9, 10) nur eine schwache Expression in der Plasmamembran und verbleiben eher zytosolisch. Die transiente Natur des Cl- Stroms von Ano1 könnte durch eine Deaktivierung über eine Calmodulin- abhängige Kinase zustande kommen. Die vorliegenden Ergebnisse demonstrieren, dass Anoctamine eine Familie von Ca2+ aktivierten Cl- Kanälen sind, die auch für Kationen permeabel sind. Sie sind sowohl in der Plasmamembran als auch im Zytosol lokalisiert. Unsere Ergebnisse werden das Verständnis über die physiologische Bedeutung der Anoctamine bei der Entstehung von Krankheiten vertiefen.
Anoctamin Proteine erzeugen einen volumen-regulierten Chlorid Strom
Alle vertebralen Zellen können ihr Volumen durch die Aktivierung eines Chlorid Kanals während der regulatorischen Volumenabnahme regulieren. Ano1 und andere Anoctamine sind funktionell CaCCs. Sie spielen eine Rolle während des Zellschwellens und werden über einen autokrinen Mechanismus, über ATP Freisetzung und Aktivierung von purinergen P2Y2 Rezeptoren aktiviert. Ein Ca2+ unabhängiger Mechanismus, an dem extrazellulär-regulierte Protein Kinasen (ERK1/2) beteiligt sind, ist ein zusätzlicher wichtiger Schritt für die Aktivierung von Ano1 durch Zellschwellung. Durch Schwellung aktivierte Cl- Ströme sind reduziert in Epithelzellen des Kolons und Azinuszellen der Speicheldrüse von Ano1 defizienten Mäusen. Darum sind Anoctamin Proteine eine kritische Komponente von epithelialen volumen-regulierten Cl- Kanälen und haben deswegen auch eine Funktion während der Zellteilung und der Apoptose.
Calmodulin- abhängige Aktivierung von Ano1
Ano1 wird während des Anstiegs der intrazellulären Ca2+ Konzentration aktiviert, aber es ist unklar ob Ca2+ direkt am Kanal wirkt oder ob zusätzliche Komponenten gebraucht werden. Wir konnten zeigen, dass Ano1 grundsätzlich in der Plasmamembran lokalisiert ist und zytoskeletale Interaktionen für die vollständige Aktivierung benötigt. Zytosolisches ATP ist für die vollständige Aktivierung notwendig, eine Phosphorylierung durch Kinasen jedoch nicht. Dagegen ist das Ca2+-bindende Protein Calmodulin unabdingbar für die Aktivierung und interagiert physikalisch mit Ano1. Öffner von Ca2+ aktivierten Kalium Kanälen mit kleinen und mittleren Leitfähigkeiten, die mit Calmodulin interagieren, aktivieren auch Ano1. Diese Ergebnisse bekräftigen die Verwendung von diesen Verbindungen für die Aktivierung einer Elektrolytsekretion in Krankheiten wie Mukoviszidose.
Kontrolle von Ano1 durch INO-4995 und anderen Inositolphosphaten
Frühere Studien deuteten an, dass CaCCs über das Membranlipid Inositolphosphat reguliert wird und die Aktivität über 1-O-octyl-2-O-butyryl-myo-inositol 3,4,5,6-tetrakisphosphate octakis (propionoxymethyl) ester (INO-4995) verstärkt werden kann. Wir untersuchten deswegen, ob Ano1 ein Angriffsziel für INO-4995 ist und ob Ano1 durch Inositolphosphate reguliert wird. Wir fanden, dass INO-4995 in Ano1 überexprimierten Zellen direkt Ano1 aktiviert. Tetrakisphosphat Ins(3,4,5,6)P4 oder Ins(1,3,4,5)P4 und Enzyme, die den Gehalt von InsP4 oder PIP2 und PIP3 regulieren, hatten keinen Effekt auf die Größe oder Kinetik des Ano1 Stroms. Dagegen wurde der endogene Cl- Strom in Xenopus Oozyten, humanen Luftwegs- und Kolonepithelzellen nicht akut von INO-4995 aktiviert. Allerdings wurde der Ano1-abhängige Strom, aktiviert durch Ionomycin oder ATP, nach Inkubation mit INO-4995 in Xenopus Oozyten und humanen Luftwegsepithelzellen verstärkt, während der intrazelluläre Ca2+ Signalweg nicht beeinflusst wurde. Unsere Daten zeigen, dass Ano1 ein Angriffsziel für INO-4995 ist, obwohl die Art der Aktivierung in über-exprimierten oder endogenen Kanälen unterschiedlich ist. Ino-4995 könnte für die Behandlung der Mukoviszidose von Nutzen sein.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 03:55
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