| License: Publishing license for publications excluding print on demand (4MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-265755
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.26575
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 31 October 2013 |
| Referee: | Prof. Dr. Achim Göpferich and Prof. Dr. Torsten Blunk |
| Date of exam: | 19 October 2012 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical Technology (Prof. Göpferich) |
| Keywords: | Adipose tissue, adipogenesis, spheroids, 3-D culture, coculture, adipose-derived stem cells, endothelial cells, vascularization, tissue engineering |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 26575 |
Abstract (English)
Today, it is well recognized that white adipose tissue represents an important endocrine organ, which is part of a complex signaling network involved in the regulation of many physiological and pathophysiological processes. Hence, adipose tissue possesses great pharmacological and therapeutic potential and is increasingly considered as a promising drug discovery target. To make use of this ...
Abstract (English)
Today, it is well recognized that white adipose tissue represents an important endocrine organ, which is part of a complex signaling network involved in the regulation of many physiological and pathophysiological processes. Hence, adipose tissue possesses great pharmacological and therapeutic potential and is increasingly considered as a promising drug discovery target. To make use of this potential, a thorough understanding of adipose tissue development and adipocyte functions is a prerequisite. However, current research in this field is largely based on conventional 2-dimensional (2 D) in vitro models, which cannot fully capture the complex microenvironment present in vivo, including the extensive cell-cell and cell-matrix interactions. Therefore, this thesis was focused on the establishment and characterization of a 3-dimensional (3 D) human adipose tissue model. Such a model system would not only be useful for basic research, but could ideally also be applied in tissue engineering and regenerative medicine, as well as in drug screening assays.
In the first part of this work a spheroid model using human adipose-derived stem cells (ASC) was successfully established. With this 3-D culture system, it was possible to produce mechanically stable spheroids of defined size, in which ASC could be induced to undergo adipogenic differentiation. Culture conditions and protocols were optimized in order to ensure tissue homogeneity, to facilitate practical handling and subsequent analytics, to enhance flexibility, and to improve cost effectiveness for routine culture.
Whereas it is well established that adipogenic differentiation involves a complex, highly regulated cascade of gene expression events, the role and influence of a tissue-like 3-D environment with respect to this process is still largely unknown. The newly developed ASC spheroid model was therefore applied to characterize the process of adipogenesis in a scaffold-free 3 D culture system on a functional and molecular level, with a special focus on the comparison to conventional 2-D culture. It was found that the application of a short-term induction protocol was sufficient to induce a strong adipogenic response in the 3 D spheroids, while lipid accumulation and the expression of marker genes were only minimal under the same conditions in 2-D. Similarly, both histology and gene expression data indicated that hormonal induction without either 3-isobutyl-methylxanthine (IBMX) or indomethacin was sufficient for the development of functional adipocytes in 3 D spheroids, but not in 2-D monolayers. These findings demonstrated that adipogenesis within the 3 D environment provided by the spheroids was less dependent on exogenous stimulation than in conventional 2-D monolayers.
In vivo, adipogenesis is closely associated with angiogenesis. The reciprocal regulation and the intensive cellular crosstalk between (pre-)adipocytes and endothelial cells is of great importance for adipose tissue development. Up to now, however, almost all of our knowledge regarding the interdependence of adipogenesis and vascular growth is based on studies using various 2 D coculture systems. Therefore, it was the aim of the second part of this thesis to establish and characterize a 3 D coculture model of human ASC and human microvascular endothelial cells (MVEC) based on the monoculture spheroids developed in the first part of this work. In a first step, suitable culture conditions were established. The elimination of EGF from the culture medium as well as the application of a short-term adipogenic induction protocol led to a sufficient adipocyte conversion without affecting MVEC viability and proliferation.
This coculture spheroid model was subsequently not only characterized with regard to cellular self-organization, but was also applied to investigate the cross-talk between the two cell types in a 3 D environment. The endothelial cells, which at first could be found preferentially on the surface of the constructs, began to accumulate in specific regions of the spheroids after several days. The formation of network-like MVEC structures could be detected in those parts of the spheroids via immunohistochemistry and confocal microscopy. Importantly, our data demonstrated that in the coculture spheroids adipogenesis was significantly impaired as compared to ASC monocultures. This was not only shown by a reduced triglyceride accumulation, but also on the molecular level, with many adipogenic marker genes being less strongly expressed in the cocultures than in the monocultures after hormonal induction. Finally, immunostaining of cryosections revealed that lipid accumulation was completely absent only in close proximity to the MVEC structures, but not in more distant regions, which suggests a local inhibitory effect of the endothelial cells on adipogenic differentiation.
Translation of the abstract (German)
Die Rolle des weißen Fettgewebes als wichtiges endokrines Organ, welches an der Regulierung vieler physiologischer und pathophysiologischer Prozesse beteiligt ist, ist heute unbestritten. Das Fettgewebe besitzt deshalb großes Potential als Zielorgan für neue pharmakologische und therapeutische Ansätze. Um dieses Potential nutzbar zu machen, ist ein grundlegendes Verständnis in Bezug auf ...
Translation of the abstract (German)
Die Rolle des weißen Fettgewebes als wichtiges endokrines Organ, welches an der Regulierung vieler physiologischer und pathophysiologischer Prozesse beteiligt ist, ist heute unbestritten. Das Fettgewebe besitzt deshalb großes Potential als Zielorgan für neue pharmakologische und therapeutische Ansätze. Um dieses Potential nutzbar zu machen, ist ein grundlegendes Verständnis in Bezug auf Entwicklung und Funktionen des Fettgewebes unerlässlich. Der Großteil der Forschung auf diesem Gebiet basiert im Moment jedoch auf konventionellen 2D-Zellkulturmodellen. Diese können die komplexe Struktur eines in-vivo-Gewebes sowie die dort vorhandenen vielfältigen Zell-Zell und Zell-Matrix-Interaktionen nur unzureichend wiedergeben. Der Fokus dieser Dissertation lag deshalb auf der Entwicklung und Charakterisierung eines humanen 3D-Fettgewebemodells. Ein solches Modellsystem wäre nicht nur für die Grundlagenforschung nützlich, sondern könnte idealerweise auch für das Tissue Engineering sowie als Drug-Screening-Tool eingesetzt werden.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde ein Sphäroidmodell basierend auf mesenchymalen Stammzellen aus dem humanen Fettgewebe (ASC) entwickelt. Dieses 3D-Kultursystem ermöglichte die Produktion von mechanisch stabilen Sphäroiden definierter Größe sowie die nachfolgende adipogene Differenzierung der ASC im 3D-Kontext. Die Kulturbedingungen wurden anschließend in Bezug auf Gewebehomogenität, Handhabung, Flexibilität und Wirtschaftlichkeit optimiert.
Die adipogene Differenzierung umfasst eine komplexe, stark regulierte Abfolge von Ereignissen auf Genexpressionsebene. Der Einfluss der gewebeimmanenten 3D-Umgebung auf diesen Prozess ist jedoch weitgehend unbekannt. Das neu entwickelte ASC-Sphäroidmodell wurde deshalb eingesetzt, um den Prozess der Adipogenese in einem 3D-Kultursystem auf funktioneller und molekularer Ebene zu charakterisieren, wobei besonders der Vergleich zur konventionellen 2D-Kultur im Mittelpunkt stand. Es zeigte sich, dass ein Kultivierungsschema mit kurzzeitiger Induktion in der Sphäroidkultur ausreichend war, um eine starke adipogene Differenzierung zu induzieren, während die Lipidakkumulation und die Expression von Markergenen unter den gleichen Bedingungen in 2D nur minimal waren. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass eine hormonelle Induktion ohne 3-Isobutyl-methylxanthin (IBMX) sowie ohne Indomethacin für die Entwicklung funktionaler Adipozyten in den 3D-Sphäroiden ausreichend war, nicht aber in den 2D-Kulturen. Durch diese Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass die Adipogenese innerhalb des 3D-Kontextes der Sphäroide weniger abhängig von exogener Stimulation war als unter 2D-Bedingungen.
Die Adipogenese ist in vivo eng mit der Angiogenese verknüpft. Die gegenseitige Regulierung und der zelluläre Crosstalk zwischen (Prä-)adipozyten und Endothelzellen sind dabei für die Fettgewebeentwicklung von großer Bedeutung. Der größte Teil unseres aktuellen Wissens über diese Wechselwirkungen basiert auf verschiedenen 2D-Cokultursystemen. Das Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war es deshalb, auf Grundlage der in ersten Teil entwickelten Monokultur-Sphäroide ein 3D-Cokulturmodell aus humanen ASC und humanen mikrovaskulären Endothelzellen (MVEC) zu etablieren und zu charakterisieren. In einem ersten Schritt wurden dazu geeignete Kulturbedingungen etabliert. Die Eliminierung von EGF aus dem Kulturmedium sowie die Anwendung eines Kulturschemas mit nur kurzzeitiger adipogener Induktion führten dabei zu einer substanziellen Adipogenese in den 3D-Cokulturen, ohne die Viabilität und die Proliferation der MVEC zu beeinträchtigen.
Das Cokultur-Sphäroidmodell wurde daraufhin nicht nur in Bezug auf die räumliche Strukturierung charakterisiert, sondern auch dazu eingesetzt, um den Crosstalk zwischen den beiden Zelltypen in einer 3D-Umgebung zu untersuchen. Die Endothelzellen, die zunächst vor allem an der Oberfläche der Konstrukte zu finden waren, begannen nach einigen Tagen, in bestimmten Regionen der Sphäroide zu akkumulieren. In diesen Teilen der Konstrukte konnten mit Hilfe der Immunhistochemie und der Konfokalmikroskopie netzwerkähnliche MVEC-Strukturen nachgewiesen werden. Interessanterweise war die Adipogenese nach hormoneller Induktion in den Cokultursphäroiden im Vergleich zu den ASC-Monokulturen signifikant reduziert. Dies wurde nicht nur durch eine geringere Triglyceridakkumulation deutlich, sondern konnte auch auf Ebene der Genexpression gezeigt werden. Die Immunfärbung von Gefrierschnitten verdeutlichte schließlich, dass die Lipidakkumulation nur in räumlicher Nähe zu den MVEC-Strukturen vollständig ausblieb, nicht aber in weiter entfernten Bereichen. Dies deutet auf einen lokal begrenzten inhibitorischen Effekt der Endothelzellen auf die adipogene Differenzierung hin.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 03:52
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