URN zum Zitieren dieses Dokuments: urn:nbn:de:bvb:355-epub-268984
Birzer, Dietmar
(2013)
Entwicklung von Enzymdesignalgorithmen mit flexibler Ligandenpositionierung.
Dissertation, Universität Regensburg.
Zusammenfassung (Deutsch)
Enzyme sind hocheffziente Biokatalysatoren, die ein breites Spektrum chemischer Reaktionen katalysieren. Diese Effzienz und die Tatsache dass Substrate in der Regel hochspezifisch umgesetzt werden, prädestiniert deren Einsatz in vielen Bereichen der Medizin und der Biotechnologie. Allerdings erfüllt nur ein kleiner Teil der wildtypischen Enzyme die speziellen Anforderungen industrieller Verfahren. ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Enzyme sind hocheffziente Biokatalysatoren, die ein breites Spektrum chemischer Reaktionen katalysieren. Diese Effzienz und die Tatsache dass Substrate in der Regel hochspezifisch umgesetzt werden, prädestiniert deren Einsatz in vielen Bereichen der Medizin und der Biotechnologie. Allerdings erfüllt nur ein kleiner Teil der wildtypischen Enzyme die speziellen Anforderungen industrieller Verfahren. Es besteht daher ein großer Bedarf nach Verfahren mit denen Enzymeigenschaften maßgeschneidert verändert werden können.
Parallel zu biochemischen Ansätzen wurden hierfür in den letzten Jahren neue Methoden des computergestützten Enzymdesigns entwickelt. Dazu gehört TransCent, das entwickelt wird um Enzymfunktionen vom nativen auf alternative Proteingerüste zu übertragen. Der Entwurf der Strukturmodelle durch TransCent zielt darauf ab, vier Bedingungen, die von fundamentaler Bedeutung für die Enzymkatalyse sind, bestmöglich zu erfüllen. Dies sind (1) die Wahrung der Proteinstabilität, (2) die Optimierung der Ligandenbindung, (3) das Einstellen des korrekten Protonierungszustandes der katalytischen Residuen und (4) das Ausbilden funktionsspezifischer Wechselwirkungen zwischen Enzym und Ligand.
TransCent findet einen Kompromiss zwischen den zum Teil widersprüchlichen Forderungen, die vier spezifische Softwaremodule zur Erfüllung jeweils einer Bedingung stellen. Drei der vier Module basieren auf den State-of-the-Art-Methoden Rosetta, PROPKA und DSX. Für die Modellierung funktionsspezifischer Wechselwirkungen wurde ein neues Konzept entwickelt, das auf wissensbasierten Potentialen beruht. Aufgrund dieses Ansatzes kann TransCent auch dann verwendet werden, wenn der Übergangszustand des Substrates und der genau enzymatische Mechanismus der betrachteten Funktion unbekannt sind. Diese Eigenschaft unterscheidet TransCent von den anderen Enzymdesignverfahren.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde TransCent um ein Modul erweitert, das die flexible Positionierung von Liganden unterstützt. Somit werden Limitationen der ersten Programmversion aufgehoben und neue Anwendungsmöglichkeiten erschlossen. Das Modul verwendet den neu entwickelten TransLig-Algorithmus zur Suche nach geeigneten Ligandpositionen. Hierbei wird die Lage des Liganden zusammen mit der Enzymsequenz unter Verwendung eines Simulated Annealing Verfahrens optimiert.
Die Performanz des Moduls zur Ligandpositionierung und des überarbeiteten Designalgorithmus wurde anhand von Rekapitulationsexperimenten basierend auf einem erweiterten und repräsentativen Enzymdatensatz bestimmt. Es zeigte sich, dass mithilfe des neuen Moduls zuverlässig nativ-ähnliche Ligandpositionen gefunden werden, die zu wildtyp-ähnlichen Designmodellen umgesetzt werden.
Um die Qualität der TransCent-Modelle einer experimentellen Überprüfung zugänglich zu machen, wurden fünf Modelle für die Übertragung der Phosphoribosylanthranilat-Isomerase-Aktivität auf das Strukturgerüst zweier Enzyme aus der Histidin-Biosynthese von Thermotoga maritima berechnet. Anhand eines dieser Beispiele wurde der Designprozess ausführlich beschrieben und das resultierende Strukturmodell detailliert analysiert. Im Labor von R. Sterner wurden die aus den Modellen resultierenden Proteine hergestellt, gereinigt und experimentell auf Stabilität, Aktivität und Bindung getestet. Alle Proteine waren stabil und drei der fünf Proteine waren in der Lage den Liganden mit annähernd wildtypischer Affnität zu binden. Allerdings besaß kein Protein eine nachweisbare Enzymaktivität. Diese experimentellen Ergebnisse belegen, dass die hier vorgestellte Version von TransCent zumindest in der Lage ist, Ligandenbindestellen korrekt zu modellieren. Damit zeigt dieses Programm einen Weg auf, ein wichtiges Teilproblem des Enzymdesigns anzugehen, welches bisher nicht zufriedenstellend gelöst wurde.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
A broad range of chemical reactions is catalyzed by enzymes, which are usually highly efficient and additionally show remarkably high substrate specificity. However, if it comes to their utilization in industrial processes, only few naturally evolved enzymes fulfill all requirements imposed by technical applications. Hence, there is a great demand for methods that allow for the design of ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
A broad range of chemical reactions is catalyzed by enzymes, which are usually highly efficient and additionally show remarkably high substrate specificity. However, if it comes to their utilization in industrial processes, only few naturally evolved enzymes fulfill all requirements imposed by technical applications. Hence, there is a great demand for methods that allow for the design of tailor-made specialist enzymes.
In addition to biochemical approaches for enzyme design several new computational methods have been developed in recent years, among them the TransCent design algorithm, which is aimed at the transfer of enzymatic functions from a template enzyme to non-native protein scaffolds. During a TransCent computation, the amino acid sequences of a number of concurrently designed models are simultaneously optimized with respect to four properties essential for enzyme catalysis: (1) protein stability, (2) ligand binding, (3) protonation states of catalytic residues and (4) function specific interactions between the substrate molecule and active site residues.
Each of these four constraints is accounted for by a particular software module. While the modules for constraints (1)-(3) are based on the state of the art methods Rosetta, DSX and PROPKA, the Fingerprint module for modeling specific protein-ligand interactions has been developed specifically for TransCent. As an alternative to the theozyme approach, the Fingerprint module utilizes knowledge based potentials, which are automatically derived from the structure of the template enzyme. Therefore, TransCent can be applied for the design of functions where the exact enzymatic mechanism or the conformation of the ligand's transition state is unknown.
The goal of this work was to add a novel feature to TransCent, which facilitates flexible ligand positioning during the design process. Thus, limitations of the first program version are overcome and a new field of potential applications is made accessible. The additional module is based on the newly developed TransLig algorithm for calculating ligand poses suitable for design. The position of the ligand is optimized along with the amino acid sequence using a simulated annealing protocol.
The performance of the module for ligand positioning and the overall design quality have been evaluated based on recapitulation experiments performed on a newly compiled dataset of 53 representative enzyme structures. The in silico results corroborate the ability of the extended design algorithm to model and identify native-like ligand positions for enzyme design.
In order to validate the quality of the predicted designs experimentally, five models designed for the transfer of the phosphoribosylanthranilate isomerase activity have been synthesized, expressed and characterized biochemically. No detectable level of enzymatic activity could be observed. However, three of the five models showed binding affinities for the product analogon rCdRP, which were significantly higher than the wildtype level of the starting construct.
Bibliographische Daten exportieren
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|
| Datum: | 2 Dezember 2013 |
|---|
| Begutachter (Erstgutachter): | apl. Prof. Dr Rainer Merkl |
|---|
| Tag der Prüfung: | 28 November 2012 |
|---|
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Rainer Merkl |
|---|
| Stichwörter / Keywords: | Computergestütztes Enzymdesign, Ligandenpositionierung, Proteindesign, Ligandenbindung, PRA-Isomerase, Rosetta, Propka, DSX, computational biology, protein design, computational enzyme design, ligand binding, active sites, ligand positioning |
|---|
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
|---|
| Status: | Veröffentlicht |
|---|
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
|---|
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
|---|
| Eingebracht am: | 02 Dez 2013 15:35 |
|---|
| Zuletzt geändert: | 02 Jun 2018 19:33 |
|---|
| Dokumenten-ID: | 26898 |
|---|
Downloadstatistik