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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-270330
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.27033
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 3 September 2013 |
| Referee: | Prof. Dr. Armin Buschauer |
| Date of exam: | 27 August 2012 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | streptococcal hyaluronidase, hyaluronate lyase, inhibitor, small molecules, multicomponent synthesis, Enzyminhibitor, Hyaluronidasen |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 27033 |
Abstract (English)
Hyaluronidases are enzymes that degrade hyaluronan, a major constituent of the extracellular matrix. As the role of hyaluronidases is far from being understood, potent and selective inhibitors are required as pharmacological tools. Moreover, inhibitors of the bacterial and mammalian enzymes might be useful agents in the treatment of various diseases, e.g. bacterial infections. Previously, we ...
Abstract (English)
Hyaluronidases are enzymes that degrade hyaluronan, a major constituent of the extracellular matrix. As the role of hyaluronidases is far from being understood, potent and selective inhibitors are required as pharmacological tools. Moreover, inhibitors of the bacterial and mammalian enzymes might be useful agents in the treatment of various diseases, e.g. bacterial infections.
Previously, we identified hyaluronidase inhibitors among lipophilic vitamin C, indole and benzoxazole derivatives. Unfortunately, such substances proved to be inappropriate for in vivo studies due to the lack of drug-like properties, in particular, due to extremely high plasma protein binding. Furthermore, substances bearing a 2-phenylindole scaffold were chemically derived from known antiestrogens. Hence, (anti)estrogenicity of phenylindole-type hyaluronidase inhibitors had to be taken into account.
The goal of this thesis was the design, synthesis, identification and pharmacological characterization of novel lead inhibitors for the bacterial hyaluronidase SagHyal4755. To give access to inhibitors suitable for in vivo characterization, the focus was set on small molecules with drug-like properties.
In a first attempt, a target-based approach led to the development of novel lead inhibitors of the streptococcal lyase SagHyal4755. For this purpose, a convenient strategy, inspired by industrial pharmaceutical research, i.e. a computer-assisted and multicomponent synthesis approach was pursued in an interdisciplinary project. An existing turbidimetric assay for the investigation of hyaluronidase inhibitors was modified and adapted to automated screening in the 96 well and 384 well format. Decision criteria for the acceptance of “hit” compounds were elaborated. A compound library comprising 347 substances was analyzed for inhibition of SagHyal4755. The structure activity relationships (SAR) were elucidated and models of the enzyme in complex with potential inhibitors were generated in silico. The suggested compounds were synthesized by parallel synthesis, analyzed and tested for biological activity in medium-throughput. Among 2640 screened samples, 4-amino-imidazolidine-2-thiones were identified as promising hits to develop inhibitors of SagHyal4755. Synthesis on the preparative scale and purification of hit compounds revealed inhibitory activity in the micromolar range. However, some derivatives proved to be prone to autoxidation and decomposition. To cope with this problem, the oxidation process was studied in detail by means of [18O] labeling and HPLC-MS analysis. The results paved the way to the synthesis of more stable molecules. 4-(1-(3,5-Dichloro-4-hydroxyphenyl)-5-hydroxy-2-thioxo-4-[4-(trifluoromethyl)benzylamino]-2,5-dihydro-1H-imidazol-5-yl)benzoic acid (UR-CT574 with an IC50 value of 8 µM) was identified as one of the most potent inhibitors of the target enzyme known so far.
Furthermore, 1352 compounds with imidazopyridine scaffold were synthesized and tested. Screening for inhibition of the bacterial hyaluronate lyase revealed several hits, which will be subject of future studies.
A subproject focused on the synthesis and pharmacological characterization of a small series of 2-phenylindoles bearing a benzyl substituent in position 1, aiming at less lipophilic compounds compared to the previously described N-alkylated indole-type inhibitors. The IC50 values of the novel compounds, especially when bearing chloro substituents, were in the micromolar range. For example, an IC50 value of 9 µM for inhibition of SagHyal4755 was determined for 4-([6,7-dichloro-2-(4-hydroxyphenyl)-3-methyl-1H-indol-1-yl]methyl)benzoic acid (UR-CT619). In addition, this compound proved to be the most potent inhibitor of a related bacterial hyaluronidase from S. pneumonia (SpnHyl) known so far (IC50 = 93 µM). These compounds are devoid of cytotoxicity against estrogen sensitive MCF-7 human breast cancer cells.
Taken together, molecules from two different chemical classes were discovered as one-digit micromolar inhibitors of the target enzyme SagHyal4755. Inhibitory activity was also observed for the streptococcal hyaluronidase SpnHyl. These compounds can be considered as lead structures for the development of inhibitors of bacterial hyaluronate lyases. Such agents might be useful in combination with antibiotics to combat bacteria producing hyaluronidase as a putative virulence factor.
Translation of the abstract (German)
Hyaluronidasen sind Enzyme, die Hyaluronsäure, einen wesentlichen Bestandteil der extrazellulären Matrix, abbauen. Da die (patho)physiologische Rolle der Hyaluronidasen weitgehend unverstanden ist, werden potente und selektive Inhibitoren als pharmakologische Werkzeuge benötigt. Zudem könnten Inhibitoren von bakteriellen und humanen Enzymen nützliche Wirkstoffe bei der Behandlung von ...
Translation of the abstract (German)
Hyaluronidasen sind Enzyme, die Hyaluronsäure, einen wesentlichen Bestandteil der extrazellulären Matrix, abbauen. Da die (patho)physiologische Rolle der Hyaluronidasen weitgehend unverstanden ist, werden potente und selektive Inhibitoren als pharmakologische Werkzeuge benötigt. Zudem könnten Inhibitoren von bakteriellen und humanen Enzymen nützliche Wirkstoffe bei der Behandlung von verschiedenen Krankheiten, wie z.B. bakteriellen Infektionen, darstellen.
In vorangegangenen Arbeiten wurden Hyaluronidase-Inhibitoren unter lipophilen Vitamin C-, Indol- und Benzoxazol-Derivaten identifiziert. Leider erwiesen sich diese Substanzen mangels arzneistoffartiger Eigenschaften, insbesondere aufgrund extrem hoher Plasmaproteinbindung, als ungeeignet für In-vivo-Studien. Zudem wurden Substanzen mit 2-Phenylindol Grundstruktur aus bereits bekannten Antiestrogenen chemisch abgeleitet. Daher muss eine mögliche (anti-)estrogene Wirkung der Hyaluronidase-Inhibitoren vom Phenylindol-Typ berücksichtigt werden.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war der Entwurf, die Synthese, Identifizierung und pharmakologische Charakterisierung neuartiger Leitstrukturen zur Hemmung der bakteriellen Hyaluronidase SagHyal4755. Der Fokus wurde dabei auf kleine Moleküle mit arzneistoffartigen Eigenschaften gerichtet, um für die In-vivo-Charakterisierung geeignete Inhibitoren zugänglich zu machen.
In einem ersten Versuch führte ein Target-basierter Ansatz zur Entwicklung neuer Leitinhibitoren der bakteriellen Hyaluronidase SagHyal4755. Computergestützte Methoden und Multikomponenten-Synthese wurden in einem interdisziplinären Projekt angewandt. Ein bestehender turbidimetrischer Assay zur Untersuchung von Hyaluronidase Inhibitoren wurde so modifiziert, dass er sich zur Anwendung im automatisierten Screening im 96-Well und 384-Well Format eignet, Zunächst wurde eine Substanzbibliothek aus 347 Substanzen auf Hemmung von SagHyal4755 geprüft. Zur Einordnung identifizierter Hemmstoffe als „Hits“ war es erforderlich, entsprechende Entscheidungskriterien zu definieren. Die Struktur-Aktivitäts-Beziehungen wurden analysiert, sowie Modelle des Enzyms im Komplex mit potentiellen Inhibitoren in silico generiert. Auf dieser Basis vorgeschlagene Verbindungen wurden in mittlerem Durchsatz durch Parallelsynthese hergestellt, mittels HPLC/MS analysiert und auf biologische Aktivität getestet. Unter 2640 untersuchten Proben erwiesen sich 4-Amino-imidazolidin-2-thione als vielversprechende Inhibitoren von SagHyal4755. Die im präparativen Maßstab nachsynthetisierten und in reiner Form gewonnenen Hit-Verbindungen zeigten Inhibition im mikromolaren Bereich. Allerdings erwiesen sich einige Derivate als chemisch labil gegenüber Luftsauerstoff. Um diese Zersetzungsreaktion aufzuklären, wurde die Oxidation mit [18O]-Sauerstoff durchgeführt und mit HPLC-MS analysiert. Diese Ergebnisse ebneten den Weg zur Synthese stabiler Moleküle: 4-(1-(3,5-Dichlor-4-hydroxyphenyl)-5-hydroxy-2-thioxo-4-[4-(trifluormethyl)benzylamino]-2,5-dihydro-1H-imidazol-5-yl)benzoesäure (UR-CT574, IC50 = 8 µM) wurde schließlich als einer der potentesten bislang bekannten Inhibitoren des bakteriellen Enzyms identifiziert.
Darüber hinaus wurden 1352 Verbindungen mit Imidazopyridin Grundgerüst synthetisiert. Das Screening dieser Substanzbibliothek auf Hemmung der bakteriellen Hyaluronatlyase lieferte mehrere Treffer, welche Gegenstand zukünftiger Studien sein werden.
Ein Teilprojekt fokussierte sich auf die Synthese und pharmakologische Charakterisierung einer kleinen Serie von 2-Phenylindolen mit Benzyl-Substituenten in Position 1. Dabei wurde auf Verbindungen abgezielt, die im Vergleich zu bekannten N-alkylierten Indol-Inhibitoren eine geringere Lipophilie aufweisen. Die neu synthetisierten Verbindungen zeigten IC50-Werte im mikromolaren Bereich, insbesondere wenn es sich um Chlor-substituierte Indole handelte. Zum Beispiel wurde für 4-([6,7-Dichlor-2-(4-hydroxyphenyl)-3-methyl-1H-indol-1-yl]methyl)benzoesäure (UR-CT619) ein IC50-Wert von 9 µM für die Hemmung von SagHyal4755 bestimmt. Darüber hinaus erwies sich diese Verbindung als einer der potentesten bislang bekannten Inhibitoren (IC50 = 93 µM) der verwandten bakteriellen Hyaluronidase aus S. pneumoniae (SpnHyl). Zudem zeigten diese Verbindungen im Unterschied zu Phenylindolen mit antiestrogener Wirkung keine Zytotoxizität gegenüber Estrogen-abhängigen humanen MCF-7 Brustkrebszellen.
Zusammengefasst wurden in zwei unterschiedlichen chemischen Klassen Inhibitoren der bakteriellen Hyaluronidase SagHyal4755 mit IC50-Werten im einstellig mikromolaren Bereich identifiziert. Auch an der Streptokokken Hyaluronidase SpnHyl wurde Hemmung beobachtet. Diese Substanzen können als Leitstrukturen für die Entwicklung von Inhibitoren der bakteriellen Hyaluronatlyasen betrachtet werden. In Kombination mit Antibiotika könnten solche Verbindungen möglicherweise zur Bekämpfung von Bakterien, die Hyaluronidase als mutmaßlichen Virulenzfaktor produzieren, eingesetzt werden.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 03:28
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