| License: Publishing license for publications excluding print on demand (1MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-271699
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.27169
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 19 December 2012 |
| Referee: | Prof. Dr. Thomas Hehlgans |
| Date of exam: | 11 December 2012 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Immunologie |
| Keywords: | Defensin, mBD14, Entzündung, mBD14:Ig transgene Maus, pro-inflammatorischer Effekt, Makrophagen |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 27169 |
Abstract (German)
β-Defensine sind wichtige Mediatoren der angeborenen Immunantwort. Neben den antimikrobiellen Eigenschaften sind sie in der Lage eine Immunantwort während einer Entzündungsreaktion zu modulieren. In der Literatur sind dabei sowohl pro- als auch anti-inflammatorische Wirkungen verschiedener β-Defensine beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss des Maus-β-Defensin 14 (mBD14) auf eine ...
Abstract (German)
β-Defensine sind wichtige Mediatoren der angeborenen Immunantwort. Neben den antimikrobiellen Eigenschaften sind sie in der Lage eine Immunantwort während einer Entzündungsreaktion zu modulieren. In der Literatur sind dabei sowohl pro- als auch anti-inflammatorische Wirkungen verschiedener β-Defensine beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss des Maus-β-Defensin 14 (mBD14) auf eine Entzündungsreaktion genauer charakterisiert.
Zunächst erfolgte die Untersuchung einer mBD14:Ig transgenen Mauslinie, mit deren Hilfe die immunmodulatorischen Eigenschaften des mBD14 in vivo analysiert werden sollten. Es konnte sowohl die transgene DNA als auch die mRNA des ubiquitär exprimierten mBD14:Ig in allen untersuchten Geweben und hämatopoetischen Zellen nachgewiesen werden. Jedoch war es nicht möglich, das mBD14:Ig transgene Protein zu detektieren. Die Untersuchung der transgenen Mauslinie in verschiedenen in vitro- und in vivo-Entzündungsmodellen ergab zudem keinen nachweisbaren Phänotyp. So wurde weder ein Unterschied in der Zytokinproduktion von TLR-stimulierten Makrophagen, von dendritischen Zellen noch von Peritonealexsudatszellen der mBD14:Ig transgenen Mauslinie im Vergleich zu WT-Tieren detektiert. Auch die TLR-Stimulierung in vivo konnte keinen Unterschied in der Zytokinkonzentration im Serum transgener Tiere oder im Prozentsatz TNF-positiver CD11b+- bzw. CD11c+-Milzzellen im Vergleich zu WT-Mäusen zeigen. Die Charakterisierung der mBD14:Ig transgenen Mauslinie erfolgte zusätzlich im Modell der akuten DSS-induzierten Colitis, in dem jedoch ebenfalls keine Unterschiede im Krankheitsverlauf zu WT-littermates detektiert wurden. Die mBD14:Ig transgene Mauslinie bot somit kein geeignetes Modell, um den Einfluss von mBD14 auf die Immunantwort in vivo zu untersuchen.
Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte auch die Untersuchung der immunmodulatorischen Wirkung von mBD14 auf myeloide Zellen. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine vierstündige Vorstimulierung von Knochenmarkmakrophagen (BMDM) mit mBD14 zu einer signifikanten und synergistischen Erhöhung der TLR-induzierten TNF-Produktion führt. Dieser pro-inflammatorische Effekt wurde neben mBD14 auch von mBD4 sowie den humanen Orthologen hBD3 und hBD2 hervorgerufen. Die erhöhte Zytokinexpression nach einer Defensin-Vorbehandlung der Zellen konnte neben LPS, dem Liganden von TLR4, auch mit CpG, poly I:C und Pam3CSK4, den Liganden von TLR9, TLR3 bzw. TLR1/2 beobachtet werden. Die Art des TLR-Stimulus spielte somit ebenfalls keine Rolle. Es konnte zusätzlich gezeigt werden, dass auch die LPS-induzierte Produktion weiterer pro-inflammatorischer Zytokine und Chemokine wie IL-6 oder CXCL2 durch eine Defensin-Vorstimulierung verstärkt wird. Neben BMDM ließ sich auch in dendritischen Zellen aus dem Knochenmark eine vermehrte TNF-Expression durch eine entsprechende Vorbehandlung induzieren. Die Defensin-Vorstimulierung zeigte zudem ihre in vivo-Relevanz durch die erhöhte TNF-Konzentration im Serum vorbehandelter Tiere im Vergleich zu einer alleinigen LPS-Stimulierung. Hierbei konnte jedoch keine statistische Signifikanz erreicht werden.
Durch die Inhibition G Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCR) mit Pertussis Toxin konnte gezeigt werden, dass der synergistische Effekt von mBD14 auf die Zytokinproduktion von Makrophagen über einen G Protein-gekoppelten Rezeptor vermittelt wird. Dies konnte durch den Einsatz eines Inhibitors der Phosphatidylinositol 3-Kinase und die Phosphorylierung der MAPK Erk1/2 bestätigt werden. Dabei handelte es sich bei dem involvierten GPCR weder um den Chemokinrezeptor CCR2 noch um CCR6, die für eine β-Defensin-vermittelte Chemotaxis hämatopoetischer Zellen verantwortlich sind. Entsprechend den gewonnen Daten scheint es auch unwahrscheinlich, dass FPRL-1 als korrespondierender Rezeptor für mBD14 dient.
Neben der vermehrten Zytokinproduktion nach einer TLR-Stimulierung induzierte mBD14 auch die verstärkte Expression von Reifungsmarkern wie CD11b und F4/80 sowie von Aktivierungsmarkern wie CD86 auf der Oberfläche von BMDM.
In der vorliegenden Arbeit konnte somit gezeigt werden, dass mBD14 neben den bisher beschrieben Rezeptoren mit einem weiteren bislang nicht identifizierten G Protein-gekoppelten Rezeptor interagiert. Eine mBD14-Vorstimulierung myeloider Zellen über diesen GPCR ist in der Lage, synergistisch und pro-inflammatorisch auf die TLR-induzierte Zytokinproduktion zu wirken. Zusätzlich fördert die mBD14-Stimulierung eine vermehrte Reifung und Aktivierung der Zellen.
Translation of the abstract (English)
Beta-defensins are important mediators of the innate immune system. Besides their antimicrobial activity, they are capable of modulating an immune response e.g. during infection. In the literature, pro- as well as anti-inflammatory effects have been described. In the course of this thesis the influence of mouse beta-defensin 14 (mBD14) on inflammatory reactions has been characterized. First of ...
Translation of the abstract (English)
Beta-defensins are important mediators of the innate immune system. Besides their antimicrobial activity, they are capable of modulating an immune response e.g. during infection. In the literature, pro- as well as anti-inflammatory effects have been described. In the course of this thesis the influence of mouse beta-defensin 14 (mBD14) on inflammatory reactions has been characterized.
First of all a mBD14:Ig transgenic mouse line was analyzed. This mouse was generated to examine the immunemodulatory functions of mBD14 in vivo. Transgenic DNA as well as mRNA of the ubiquitous expressed mBD14:Ig was detected in all analyzed tissues and hematopoetic cells. However it was not possible to detect the mBD14:Ig protein. Moreover, the analysis of the mBD14:Ig transgenic mouse line in different in vitro and in vivo inflammation models revealed no verifiable phenotype. There was no difference in the cytokine production of TLR-stimulated macrophages, dendritic cells or peritoneal exsudate cells of the mBD14:Ig transgenic mouse line compared to WT animals. There was also no difference in cytokine expression in the serum of mBD14:Ig transgenic mice after TLR stimulation in vivo nor in the numbers of CD11b+ or CD11c+ cells in the spleen compared to WT controls. Furthermore, the characterization of the mBD14:Ig transgenic mouse line in acute DSS-induced colitis revealed no differences in the course of disease compared to WT littermates. Therefore the mBD14:Ig transgenic mouse line was no adequate model to analyze the influence of mBD14 on inflammatory reactions in vivo.
Next, the immunemodulatory effect of mBD14 on myeloid derived cells was analyzed in this thesis. It was shown, that a four-hour pre-stimulation of bone marrow derived macrophages (BMDM) with mBD14 leads to a significant and synergistic increase in TLR-induced TNF production. Besides mBD14 also mBD4 and the human orthologues hBD3 and hBD2 were able to induce this pro-inflammatory effect. The increased TNF production after mBD14 pre-treatment of macrophages was seen with LPS, CpG, poly I:C and Pam3CSK4 as ligands for TLR4, TLR9, TLR3 and TLR1/2, respectively. In addition to TNF also the TLR-induced production of the pro-inflammatory cytokine IL-6 and the chemokine CXCL-2 were increased after beta-defensin pre-stimulation. Besides BMDM also bone marrow derived dendritic cells (BMDC) were able to induce higher TNF levels after mBD14 pre-treatment. Furthermore, pre-stimulation with different beta-defensins led to increased cytokine production after TLR stimulation in vivo, although these experiments did not reach statistical significance.
The inhibition of G protein-coupled receptors (GPCRs) with Pertussis toxin demonstrated that the pro-inflammatory effect of mBD14 was mediated via a GPCR. This result was further verified by using a phosphatidylinositol-3 kinase inhibitor and the detection of ERK1/2 phosphorylation after beta-defensin stimulation. The involved GPCR was neither CCR2 nor CCR6, which are responsible for beta-defensin-mediated chemotaxis of hematopoetic cells. FPRL-1 seems equally unlikely to be the corresponding receptor for mBD14.
Besides the increased cytokine production, mBD14 induced increased expression of maturation markers like CD11b and F4/80 as well as activation markers like CD86 on BMDM.
In summary, this work demonstrates that mBD14 is able to interact with an additional so far unknown G protein-coupled receptor. The mBD14 pre-stimulation of myeloid cells via this receptor has a synergistic and pro-inflammatory effect on the TLR-induced cytokine production. Additionally, mBD14 pre-treatment results in an increased maturation and activation of primary BMDM.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 03:26
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