Molekulare Mechanismen der Retinadegeneration. Aufklärung der erblichen Retinadegenerationen Sorsby Fundusdystrophie und Retinitis Pigmentosa (RP28) - Pathomechanismus und Funktion der beteiligten Proteine - University of Regensburg Publication Server

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-282074

Zach, Frank

Preview

License: Publishing license for publications excluding print on demand
PDF
(4MB)

Date of publication of this fulltext: 16 May 2013 13:10

Details

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	16 May 2013
Referee:	Prof. Dr. Ernst Tamm
Date of exam:	13 May 2013
Institutions:	Medicine > Lehrstuhl für Humangenetik Biology, Preclinical Medicine > Institut für Anatomie > Lehrstuhl für Humananatomie und Embryologie
Keywords:	Retinitis Pigmentosa, FAM161A, Sorsby Fundusdystrophie, TIMP3
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	28207

Preview

Export bibliographical data

Abstract (German)

Abstract (German)

Die vorliegende Arbeit hatte die molekularen Pathomechanismen der beiden erblichen retinalen Degenerationen der Sorsby Fundusdystrophie (SFD), sowie der RP28-vermittelten Retinitis Pigmentosa (RP) zum Thema. Durch die funktionelle Charakterisierung der jeweiligen Proteine TIMP3 und FAM161A, sowie den Krankheits-assoziierten Mutationen sollten die zuvor postulierten Pathomechanismen erweitert (SFD) bzw. neue Teilaspekte (RP28) ermittelt werden.

Punktmutationen des BM-gebundenen Proteins TIMP3 können zur Sorsby Fundusdystrophie führen. Pathologisch veränderte Proteineigenschaften, vor allem aufgrund von ungepaarten Cysteinresten, können die Akkumulation von TIMP3 und eine Verdickung im Bereich der BM bewirken. In dieser Arbeit wurden im Zuge von Timp3-Genexpressionsstudien keine Hinweise auf eine erhöhte mRNA-Menge als Folge der S156C-Mutation gefunden. Ultrastrukturelle und histologische Experimente mit Retinaschnitten der Augen von Mäusen der Genotypen Timp3+/+, Timp3S156C/+ und Timp3S156C/S156C eines CD1-Albinohintergrunds, sowie Proteasomaktivitätstests mit isolierten Fibroblasten und primären RPE-Zellen aus Timp3 -/-, Timp3 +/+, Timp3 S156C/+ und Timp3 S156C/S156C Mäusen lieferten ebenfalls keine Anzeichen auf Veränderungen der untersuchten phänotypischen Aspekte (S156C-TIMP3 induzierte Entzündungsprozesse, TIMP3-Fehllokalisierung, gestörte Proteasomaktivitäten) als Folge der TIMP3-Mutation S156C. Radioaktive Fütterungsstudien von Fibroblasten- und RPE-Zellkulturen konnten eine erhöhte EZM-Produktion als Folge der heterozygoten Mutation S156C-TIMP3 verdeutlichen. Im Verlauf von Interaktionsstudien mit Fibroblasten- und HEK293-EBNA-Zellen mit EZM-gebundenen endogen bzw. heterolog exprimierten TIMP3-Varianten konnte der Einfluss verschiedener TIMP3-Punktmutationen auf die Assoziation mit Trypsin-sensitiven Komponenten der EZM nachgewiesen werden. Die in der vorliegenden Arbeit erhaltenen Resultate bezüglich des Pathomechanismus der autosomal dominant vererbten SFD legen somit eine Zugewinnfunktion der mutierten TIMP3-Proteine nahe.

Homozygote Nullmutationen in FAM161A konnten kürzlich als Ursache für die RP28-vermittelte Retinitis Pigmentosa identifiziert werden. Die vorliegende Arbeit zielte auf eine anfängliche Charakterisierung des neuen ziliären Proteins ab. Zur sub-zellulären Lokalisierung von FAM161A in retinalen Dünnschnitten wurden zwei Antikörperseren gegen homologe FAM161A-Versionen hergestellt und erfolgreich aufgereinigt. Lokalisierungsstudien in murinen und humanen Netzhäuten konnten FAM161A im Verbindungszilium sowie im Basalkörper und der anliegenden Zentriole in den Photorezeptoren nachweisen (Zach et al. 2012). Außerhalb der Photorezeptoren konnte FAM161A im Bereich der äußeren Körnerschicht, sowie der Ganglienzellschicht lokalisiert werden (Zach et al. 2012). Immunelektronenmikroskopische Experimente bestätigten die FAM161A-Präsenz im Verbindungszilium und im Basalkörper und deuteten auf eine direkte Assoziation mit Mikrotubulistrukturen hin (Zach et al. 2012). Durch die heterologe Expression von FAM161A in HEK293-EBNA-, COS7- und den ziliierten LLC-PK1-Zellen, sowie durch immunologische Lokalisierung konnte eine Anlagerung des rekombinanten Proteins an zytoplasmatische und zentrosomale Mikrotubulistrukturen ermittelt werden. Die Assoziation von FAM161A an Mikrotubuli, die durch in vitro Bindungsexperimente als direkte physikalische Interaktion charakterisiert werden konnte, bewirkte einen erhöhten Acetylierungslevel der α-Tubulinuntereinheiten der Mikrotubuli und eine gesteigerte Stabilisierung des Netzwerks gegenüber einer Behandlung mit dem depolymerisierenden Reagenz Nocodazol. Rekombinantes GST-FAM161A_230-543 hatte in vitro keinen Einfluss auf den Polymerisierungsprozess von monomerem Tubulin zu Mikrotubulistrukturen. In vitro Interaktionsstudien ergaben homo- und heterotypische FAM161A-FAM161A- bzw. FAM161A-FAM161B-Interaktionen, die eine mögliche Gerüstproteinfunktion der FAM161-Proteine vermitteln könnten. Ein Hefe-2-Hybrid-Experiment zur Ermittlung direkter FAM161A-Interaktionspartner lieferte die potentiellen Wechselwirkungen mit den Kandidatenproteinen KIF3A, KIF1A, KIF21B, DCTN1 und MAPK8IP3, mit deren Validierung in der vorliegenden Dissertation begonnen wurde. Durch die vielfältigen Funktion und Bindungspartner des FAM161A-Proteins ergeben sich diverse Ansatzpunkte für die Aufklärung des RP28-assoziierten Pathomechanismus. Aufgrund des autosomal rezessiven Erbgangs und der bisher erzielten Ergebnisse ist weiterhin, entsprechend den Erwartungen, von einem Verlust der Proteinfunktion als Folge der FAM161A-Mutationen in RP28-Patienten auszugehen. Zusammenfassend eröffnen die Ergebnisse der in der vorliegenden Arbeit durchgeführten funktionellen Charakterisierung des RP-assoziierten Proteins FAM161A mehrere Ansatzpunkte für dessen weiterführende Charakterisierung und eine noch detaillierte Aufklärung des durch FAM161A-Nullmutationen induzierten RP28-Pathomechanismuses.

Translation of the abstract (English)

The subject of the present study covered the pathomechanisms of the two hereditary retinal degenerations Sorsby fundus (SFD) and RP28-mediated retinitis pigmentosa (RP). By the functional characterization of the proteins TIMP3 and FAM161A, pathogenetic mechanisms were extended and new aspects were determined.

Point mutations of TIMP3 protein can lead to SFD. Pathologically altered protein properties, mainly due to unpaired cysteine residues can cause the accumulation of TIMP3 and a thickening of the Bruch's membrane (BM). In this work, no evidence of increased mRNA levels were found as a result of the S156C mutation in the course of TIMP3 gene expression studies. Ultrastructural and histological experiments with retinal sections of eyes of mice with the genotypes TIMP3 +/+, Timp3 S156C/+ and Timp3 S156C/S156C (CD1 albino background) and proteasome activity assays with isolated fibroblasts as well as primary RPE cells from Timp3 -/-, TIMP3 +/+, Timp3 S156C/+ and Timp3 S156C/S156C mice also provided no evidence for changes of the studied phenotypic aspects (S156C-TIMP3-induced inflammation, TIMP3 mislocalization, impaired proteasomal activity) as a result of TIMP3 mutation S156C. Radioactive feeding studies of fibroblasts and RPE cell cultures were able to demonstrate an increased ECM production as a result of the heterozygous mutation S156C-TIMP3. In the course of interaction studies with fibroblasts and HEK293-EBNA cells with extracellular matrix-bound endogenous or heterologously expressed TIMP3 variants the influence of different TIMP3 point mutations on association with trypsin-sensitive components of the ECM could be detected. The results obtained in the present study regarding the pathogenic mechanism of autosomal dominant inherited SFD thus suggest a gain of function of mutant TIMP3 proteins.

Recently, homozygous null mutations in FAM161A could be identified as the cause of RP28-assoziated retinitis pigmentosa. The present study was aimed for the initial characterization of the new ciliary protein. For sub-cellular localization of FAM161A in retinal thin sections, two antibody sera against homologous FAM161A versions were prepared and successfully purified. Localization studies in mouse and human retinas detected FAM161A in the connecting cilium, in the basal bodies and the adjacent centriole in photoreceptors (Zach et al., 2012). Outside the photoreceptors FAM161A was detected in the outer nuclear layer and the ganglion cell layer (Zach et al., 2012). Immune electron microscopy experiments confirmed the presence of FAM161A in the connecting cilium and the basal bodies and thus suggested a direct association with microtubule structures (Zach et al., 2012). FAM161A could be localized to cytoplasmic and centrosomal microtubules by heterologous expression of FAM161A in HEK293-EBNA, COS7 and the ciliated LLC-PK1 cells and immunological detection of the recombinant protein. Association of FAM161A to microtubules, which could be characterized as a direct physical interaction by in vitro binding experiments, induced an increase in the acetylation of α-tubulin. FAM161A expression increased stabilization of the microtubule network against treatment with the depolymerizing reagent nocodazole. Recombinant GST-FAM161A_230-543 had no effect on in vitro polymerization of microtubules from monomeric tubulin. In vitro interaction studies of homo-and heterotypical FAM161A-FAM161A and FAM161A-FAM161B interactions provided a possible function of the FAM161-family as scaffold proteins. A yeast two-hybrid experiment to determine direct interaction partners of FAM161A showed potential interactions of FAM161A with the candidate proteins KIF3A, KIF1A, KIF21B, DCTN1 and MAPK8IP3. Due to the autosomal recessive mode of inheritance and the results achieved so far, a loss of protein function mechanism as a result of FAM161A mutations in RP28 patients can be assumed.

Owner only: item control page

Download Statistics