Intrazellulärer Transport von Zilium-assoziierten Proteinen

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-283783
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.28378

Gürster, Sonja

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Date of publication of this fulltext: 18 Jun 2013 11:15

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	18 June 2013
Referee:	Prof. Dr. Ralph Witzgall
Date of exam:	31 May 2013
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Anatomie > Lehrstuhl für Molekulare und zelluläre Anatomie > Prof. Dr. Ralph Witzgall
Keywords:	ADPKD, Polycystin-2, Primäres Zilium, primary cilium
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	28378

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Abstract (German)

Abstract (German)

Anhand von transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen an renalen Tubulus-Epithelzellen sollten weitere Einblicke in die autosomal-polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD) gewonnen werden. Dieser Krankheit liegt eine Fehlfunktion eines antennenartigen Zellorganells, des primären Ziliums, zugrunde, welches u. a. durch Mutationen des integralen Membranproteins Polycystin-2 (PC2) verursacht wird. Dieses Protein ist sowohl im Zytoplasma, als auch intraziliär lokalisiert, was aus früheren fluoreszenzmikroskopischen Arbeiten bereits bekannt war. Der Transport vom Zellkörper in das primäre Zilium konnte bis dato allerdings noch nicht geklärt werden. Korrelative licht- und transmissionselektronenmikroskopische Versuche sollten dazu beitragen, aus den funktionellen Informationen durch die Fluoreszenz-Mikroskopie kombiniert mit (ultra-)strukturellen Informationen, gewonnen aus der Transmissions-Elektronenmikroskopie, weitere Erkenntnisse zum Transport von Polycystin-2 zu gewinnen. Das Protein kann somit unter dem Fluoreszenzmikroskop in vivo detektiert und seine Translokation in der Zelle verfolgt werden; anschließend ermöglicht eine Photooxidation, dasselbe Protein im Elektronenmikroskop mit höherer Auflösung zu analysieren. Dazu wurde eine für die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie angewandte Methode der Tetracystein-basierten Proteindetektion mittels ReAsH an den Nierenepithelzellen etabliert und elektronentomographische Untersuchungen für die morphologische und ultrastrukturelle Charakterisierung des primären Ziliums und dessen Basalstruktur von hochdruckgefrorenen Nierenepithelzellen durchgeführt.

Die Tetracystein-basierte Protein-Detektionsmethode wurde mit mehreren vom Polycystin-2 abgeleiteten Protein-Mutanten durchgeführt, welche die Hypothese des Vesikeltransports erneut belegten. Ein Begleit-Ergebnis dieser Untersuchungen war die Translokation des Volllängen-Polycystin-2 Proteins mit einem integrierten Tetracystein-Motiv und einem zusätzlichen GFP-Tag ins primäre Zilium, was bis dato nicht beobachtet werden konnte.

Im Zuge dieser Arbeit zeigten 3D–Rekonstruktionen und –Visualisierungen von elektronentomo-graphischen Untersuchungen von primären Zilien und dessen Basalkörperchen eindeutig das Vorkommen von Vesikeln im Inneren des Mikrotubuli-Achsenskeletts des Basalkörperchens und der ‚Übergangszone‘ zum primären Zilium. Dies wird einerseits durch die Größenzuordnung und des Weiteren durch das Vorkommen einer eindeutigen Doppelmembran belegt. Die Kombination der im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse führt zu der Hypothese eines neuen Modells eines Transportmechanismus von integralen Zilien-assoziierten Membranproteinen.

Translation of the abstract (English)

Transmission electron microscopy studies of renal epithelial cells should provide further insights into autosomal polycystic kidney disease (ADPKD). This disease is based on a malfunction of an antenna-like cellular organelle, the primary cilium, caused by mutations of the integral membrane protein Polycystin-2 (PC2). This protein is localized in the cytoplasm as well as in the cilium, which was already known from previous fluorescence microscopy studies. The translocation from the cell body into the primary cilium could not yet been elucidated. Correlative light and transmission electron microscopy experiments should help to combine functional information by fluorescence microscopy with (ultra-)structural information obtained by transmission electron microscopy to gain further insights into the transport of Polycystin-2. The protein and also its translocation in the cell can therefore be examined in vivo by fluorescence microscopy and secondly the same protein can be analyzed at a higher resolution by electron microscopy after the photo-oxidation reaction. Therefore, a method applied for correlative light and electron microscopy called Tetracysteine-based protein detection using ReAsH was established with renal epithelial cells and combined with electron-tomographic studies aiming to analyze and characterize the ultrastructure of the primary cilium and its basal structure, using high-pressure frozen kidney epithelial cells.

The Tetracysteine-based protein detection method was performed with several protein mutants derived from Polycystin-2, which demonstrated again the hypothesis of vesicular transport. An incidental result of these investigations was the observation that the full-length protein Polycystin-2 with an integrated Tetracysteine-motif and an additional GFP-tag is translocated into the primary cilium – which has not been described so far.

In the course of this work 3D-reconstructions and -visualizations of electron-tomographic studies of primary cilia and its basal body obviously showed the presence of vesicles inside the microtubule axial skeleton of basal bodies and in the transition zone of the primary cilium. The interpretation is based on two facts, the size of the vesicles and that it is delinated by a clear, distinct double-track membrane. The combination of the results obtained in this work leads to the hypothesis of a new model of a transport mechanism of integral ciliar membrane proteins.

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