Expressions- und Immunogenitätsstudien einer neuen Generation sequenzmodifizierter HIV-1 Subtyp B gagpolnef DNA Vakzinekandidaten

URN zum Zitieren dieses Dokuments:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-284033
DOI zum Zitieren dieses Dokuments:: 10.5283/epub.28403

Röttger, Lydia

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Veröffentlichungsdatum dieses Volltextes: 02 Jul 2013 14:23

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Dokumentenart:	Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation)
Open Access Art:	Primärpublikation
Datum:	2 Juli 2013
Begutachter (Erstgutachter):	Prof. Dr. Ralf Wagner
Tag der Prüfung:	21 Juni 2013
Institutionen:	Medizin > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene
Stichwörter / Keywords:	HIV-1B, gagpolnef, DNA-Vakzine
Dewey-Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin
Status:	Veröffentlicht
Begutachtet:	Ja, diese Version wurde begutachtet
An der Universität Regensburg entstanden:	Ja
Dokumenten-ID:	28403

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Zusammenfassung (Deutsch)

Zusammenfassung (Deutsch)

In der vorliegenden Arbeit wurden modifizierte HIV-1 Vakzinekandidaten hinsichtlich ihrer Expression und Immunogenität untersucht. Der RNA- und kodonoptimierte Leserahmen der Impfstoffvarianten basierte auf dem HIV-Subtyp B und kodierte für synthetische GagPolNef- bzw. PolNef-Polyproteine, die sich bezüglich des Vorhandenseins des natürlichen HI-viralen ribosomalen Leserastersprunges, von Nef sowie der Aktivität der viralen Protease unterschieden. Aus Sicherheitsgründen wurde die Integrase deletiert und die Reverse Transkriptase inaktiviert, darüber hinaus wurde das Myristylierungssignal in Gag entfernt. Neu wurde an die 3`-terminalen Enden der Varianten die Gensequenz von env-V3, die ein gut charakterisiertes H-2d-restringiertes T-Zell-Epitop kodiert, als Reporter angefügt, um im Rahmen von in vivo-Studien zusätzlich zu Gag-spezifischen T-Zellen auch Aussagen zu potentiellen PolNef-spezifischen T-Zell-Antworten zu ermöglichen.
Die getesteten GagPolNef-Impfstoffkandidaten waren in der Lage, sowohl humorale als auch CD8+ T-Zell-Immunantworten gegen Gag bzw. den env-V3-Reporter (V3) zu induzieren. Die Synthese des 160 kD GagPolNef-Durchleseproteins im Ausgangskonstrukt resultierte in detektierbaren, aber niedrigen Gag (A9I)- und V3-spezifischen T-Zell-Antworten. Diese T-Zell-Antworten sowie die Expression der Vakzinekandidaten konnten weder durch Deletion des nef-Gens noch durch Aktivierung der viralen Protease verbessert werden, wohingegen das Wiedereinfügen des natürlichen HI-viralen ribosomalen Leserastersprunges die Expressionsraten von Gag steigern und stärkere Gag- und V3-spezifische T-Zell-Antworten induzieren konnte. Demgegenüber induzierten Konstrukte, die die funktionsfähige virale Protease enthielten, schwächere Epitop-spezifische Immunantworten. Die effizienteste Immunantwort gegen Gag und V3 wurde durch das GagPolNef-Polygen-Konstrukt erreicht, das neben einem funktionellen Leserastersprunges eine inaktive Protease und kein Nef enthielt.
Des Weiteren wurden unterschiedliche PolNef-Varianten entworfen, um das Vektorinsert zu verkleinern und so die Aufnahme der Plasmide und nachgelagert die Expression der Impfstoffkandidaten zu verbessern. Auch hier wurde entsprechend die V3-Gensequenz 3´-terminal an den Leserahmen angefügt, mit Hilfe derer die Auslese stattfand. Korrelierend zu den obigen Ergebnissen wirkte sich auch bei den PolNef-Varianten die Inaktivierung der Protease positiv auf die Immunogenität der Vakzinekandidaten aus. Die Deletion der nef-Sequenz führte zudem zu gesteigerten zellulären Immunantworten. Darüber hinaus konnte bei den Varianten ohne gag- und nef-Gensequenz ein Anstieg der Pol-spezifischen T-Zell-Antworten verzeichnet werden.

Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)

The present study evaluated the impact of modified HIV-1 DNA vaccine candidates on expression and immunogenicity. The RNA- and codon-optimized reading frame basing on HIV-1 subtype B comprised either synthetic GagPolNef or PolNef polyproteins differing in the natural HIV ribosomal frameshift, Nef and the activity of the viral protease. Additional safety features included the removal of the integrase and inactivation of the reverse transcriptase (RT) as well as the removal of the myristoylation signal in Gag. The env-V3 sequence, encoding for a well characterized H-2d-restricted T-cell epitope, was subsequently fused to the 3´ terminus as a reporter to allow assessing potential PolNef-specific T-cell responses besides Gag-specific T-cell responses in in vivo studies in BALB/c mouse model.
The evaluated gagpolnef DNA vaccine candidates were able to induce humoral responses as well as CD8+ T-cell responses directed against Gag and the env-V3 reporter (V3). Synthesis of the 160kD GagPolNef protein derived from the basic construct, resulted in detectable, but low Gag (A9I) and V3-specific T-cell responses. These T-cell responses as well as expression levels could neither be increased by deletion of nef or activation of the viral protease whereas the reintroduction of the natural HIV ribosomal frameshift enhanced expression rates of Gag and was able to induce more potent Gag- and V3-specific T-cell responses. In contrary, constructs containing the functional viral protease, induced weak epitope specific immune responses. The most efficient immune response against Gag and V3 derived epitopes was achieved by the gagpolnef-polygene construct containing a functional frameshift, an inactive protease and no Nef.
As second objective, different PolNef variants were designed for minimizing vector inserts and thereby improve plasmid uptake and expression levels. As well, the V3-sequence was placed 3´-terminal at the variants, allowing the detection of PolNef reading frame. Correlating to GagPolNef results, an inactive protease enhanced immunogenicity. In contrary, PolNef variants lacking besides gag- the nef-sequence obtained increased cellular immune responses.

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