| License: Publishing license for publications excluding print on demand (1MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-284460
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.28446
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 4 July 2013 |
| Referee: | Prof. Dr. Thomas Hehlgans and PD Dr. Wulf Schneider |
| Date of exam: | 3 July 2013 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Immunologie |
| Keywords: | Defensin, ELISA, Luciferase |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 28446 |
Abstract (German)
Die humanen β-Defensine hBD2 und hBD3 spielen als antimikrobielle Peptide eine wichige Rolle bei der Abwehr gegen pathogene Mikroorganismen. Das Wirkspektrum von den beiden Defensinen umfasst zahlreiche Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten. Weiterhin ist ihnen die Eigenschaft der Chemotaxis sowie der Induktion gemeinsam. hBD2 und hBD3 werden außerdem in Verbindung mit mehreren klinisch ...
Abstract (German)
Die humanen β-Defensine hBD2 und hBD3 spielen als antimikrobielle Peptide eine wichige Rolle bei der Abwehr gegen pathogene Mikroorganismen. Das Wirkspektrum von den beiden Defensinen umfasst zahlreiche Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten. Weiterhin ist ihnen die Eigenschaft der Chemotaxis sowie der Induktion gemeinsam. hBD2 und hBD3 werden außerdem in Verbindung mit mehreren klinisch relevanten Erkrankungen gebracht.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der Rolle der humanen beta Defensine 2 und 3 im entzündlichen und malignen klinischen Kontext. Um die hBD2- und hBD3-Konzentrationen im Patientenserum genau quantifizieren zu können, erfolgte zunächst die Etablierung von ELISAs für die beiden Defensine.
In diesem Zusammenhang wurden zunächst Messungen der Defensinkonzentrationen im Serum von Patienten mit einer vorliegenden MRSA-Infektion der Haut durchgeführt. Dabei zeigten sich bei Patienten mit tiefen MRSA- positiven Hautulcera im Vergleich zur Kontrollgruppe deutlich erhöhte hBD2 Serum Spiegel.
Zudem wurden die hBD2- und hBD3-Konzentrationen im Serum einer 42-jährigen Patientin, die an rezidivierenden bronchopulmonalen Infekten leidet, bestimmt. Da einheitliche Normwerte für die Serum Defensinspiegel in der Literatur fehlen, wurden die Serum-Defensinkonzentrationen der Patientin mit denen ihrer Kinder verglichen. Dabei zeigten sich bei der Indexpatientin hochsignifikant niedrigere hBD2- und signifikant höhere hBD3-Spiegel als bei ihren Kindern.
Weiterhin erfolgte die hBD2- und hBD3-Konzentrationsbestimmung im Humanserum von knochenmarktransplantierten Patienten, die verschiedene maligne hämatologische Erkrankungen aufwiesen. Ein zusätzliches Unterscheidungsmerkmal bei der Bestimmung der hBD2- und hBD3-Spiegel war die Entwicklung einer Graft-versus-Host-Reaktion. Dabei konnte nach einem initialen hBD2-Anstieg am Tag der Knochenmarktransplantation ein signifikanter Abfall der Defensinkonzentration in der frühen Phase nach allogener KMTx beobachtet werden. Im Gegensatz dazu ließen sich bei der hBD3-Bestimmung keine signifikanten Konzentrationsänderungen im Zusammenhang mit der Transplantation feststellen.
Im Rahmen einer Zellkultur mit stabil transfizierten HEK-293 Zellen (hBD2-Promotor/Firefly Luciferase Reporter Vektorkonstrukt) wurde mit Hilfe eines Luciferase Reportergen-Assays die Wirkung verschiedener proinflammatorischer Stimuli auf die Aktivierung des hBD2 Promotors untersucht. Dabei führten die bakteriellen Bestandteile MDP und LPS zu einer deutlichen Steigerung der Luciferase Aktivität als Maß für die hBD2-Expression, während bei PG, Pam 3 Cys und Zym Aktivitätswerte im Bereich der unstimulierten Kontrollen gemessen wurden.
In einem weiteren Versuch erfolgte die Stimulation der transfizierten HEK-293 Zellen mit Lysaten verschiedener Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien. Um festzustellen, inwieweit die eingesetzte Menge der Bakterienlysate eine Rolle bei der Promotoraktivierung spielt, wurden die Bakterienlysate in unterschiedlichen Mengen eingesetzt.
So konnte nach der Stimulierung der HEK-293-Zellen mit Lysaten aus allen eingesetzten Gram-negativen Bakterien (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli und Neisseria lactamica) eine Steigerung der Reportergen-Aktivität dokumentiert werden. Diese im Vergleich zu der unstimulierten Kontrolle erhöhte Luciferase-Aktivität konnte nach der Inkubation mit den Bakterienlysaten in allen in diesem Versuch getesteten Konzentrationen erzielt werden.
Unter allen eingesetzten Gram-positiven Bakterien (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis und Enterococcus faecalis) konnte dagegen nur bei Bacillus subtilis Lysat in einer Konzentration von 10 µl/Well eine signifikante Steigerung der hBD2 Expression beobachtet werden.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass der Kontakt mit pathogenen Mikroorganismen/mikrobiellen Bestandteilen zu einer Erhöhung der hBD2 und hBD3 Konzentrationen sowohl im Patientenserum, als auch auf Promotorebene führt. Damit konnte die wichtige Rolle der beiden ß-Defensine für die adäquate Immunantwort gezeigt werden.
Translation of the abstract (English)
As antimicrobial peptides the human β-defensines hBD2 and hBD3 are involved in the host defense against several microbial pathogens. These defiensins show activity against several bacteria, viruses, fungi and parasites and serve as chemoattractants. Additionally hBD2 and hBD3 are involved in the pathogenesis of several diseases. This thesis should characterize the role of the human beta ...
Translation of the abstract (English)
As antimicrobial peptides the human β-defensines hBD2 and hBD3 are involved in the host defense against several microbial pathogens.
These defiensins show activity against several bacteria, viruses, fungi and parasites and serve as chemoattractants. Additionally hBD2 and hBD3 are involved in the pathogenesis of several diseases.
This thesis should characterize the role of the human beta defensins hBD2 and hBD3 in the inflammatory and malign context.
To determine the defensin-concentrations in the serum of patients, an ELISA protocol was established. In this context serum defensin concentrations of patients with dermal MRSA-infections have been measured. In this analysis patients with deep, MRSA infected dermal ulcerations showed increased hBD2 serum levels.
Additionally the hBD2 and hBD3 concentrations of a 42 years old female patient suffering from recurrent bronchopulmonal infections have been analyzed. Due to the lack of reference levels for serum defensin concentrations in literature, the defensin levels of the patient were compared to those of her children. This analysis showed significantly decreased hBD2 and significantly increased hBD3 concentrations in the serum of the index patient compared to her children.
Furthermore hBD2 and hBD3 concentrations in the serum of bone marrow transplant patients with several malignant hematological diseases have been analyzed. These patents were grouped according to the development of a graft-versus-host disease. After an initial hBD2 level increase at the day of transplantation a significant decrease of the defensine concentration could be observed in the early phase after the allogeneic transplantation. In contrast to this the hBD3 levels showed no significant correlation to the transplantation.
Cell cultures have been performed using stabile transfected (hBD2-promotor/firefly luciferase reporter vector) HEK-293 cells. A luciferase reportergene-assay was used to monitor the effect of different pro-inflammatory stimuli on the activation of the hBD2-promotor. An increase of luciferase activity as indicator of hBD2-expression was observed after stimulating the cells with the bacterial components MDP and LPS. In contrast, PG, Pam 3 Cys and Zym stimulation resulted in luciferase activity levels in the range of the unstimulated controls.
In an additional experiment the transfected HEK-293 cells were stimulated with lysates of different gram-positive and gram-negative bacteria in several concentrations.
Stimulation with the lysate of all used gram-negative bacteria (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli and Neisseria lactamica) in all applied concentrations led to an increase of reportergene activity.
Stimulating with lysates of gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis and Enterococcus faecalis), only Bacillus subtilis lysate in a concentration of 10 µl/well led to a significant increase of hBD2 expression.
Concluding the mentioned above, contact to pathogenic microbial components leads to an increase of hBD2 and hBD3 concentration in the serum of patients as well as to an increased defensine promotor activation. These findings emphasize the important role of beta defensines in immune responses.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 02:08
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