| License: Publishing license for publications excluding print on demand (4MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-289435
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.28943
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 31 October 2013 |
| Referee: | Prof. Dr. Jörg Heilmann |
| Date of exam: | 10 October 2013 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical Biology (Prof. Heilmann) |
| Keywords: | Weidenrinde, Salix, Willow Bark, bioaktivitätsgeleitete Isolierung, Flavonoid-Quantifizierung, anti-inflammatory, entzündungshemmend, Salicortin, Tremulacin, Catechol, Glucuronidsynthese, pharmakokinetische Studie, in vitro, in vivo, Serum-Quantifizierung HPLC-DAD |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 28943 |
Abstract (German)
In klinischen Studien sowie in verschiedenen Tiermodellen wurde die analgetische Wirksamkeit und die entzündungshemmende Wirkung von Weidenrindenextrakten gezeigt. Pharmakokinetische Studien belegten allerdings, dass für diese Wirkung nicht allein die aus den Salicylalkoholderivaten entstehende Salicylsäure verantwortlich gemacht werden kann. In dieser Arbeit sollten die Wirkungen der ...
Abstract (German)
In klinischen Studien sowie in verschiedenen Tiermodellen wurde die analgetische Wirksamkeit und die entzündungshemmende Wirkung von Weidenrindenextrakten gezeigt. Pharmakokinetische Studien belegten allerdings, dass für diese Wirkung nicht allein die aus den Salicylalkoholderivaten entstehende Salicylsäure verantwortlich gemacht werden kann. In dieser Arbeit sollten die Wirkungen der Salicylalkoholderivate in der Weidenrinde in Abgrenzung zur Salicylsäure genauer untersucht werden, um gegebenenfalls neue Wirkprinzipien der Droge zu entdecken.
Eine bioaktivitätsgeleitete Fraktionierung eines 70% ethanolischen Weidenrindenextraktes mit dem ICAM-1 Assay als anti-inflammatorisches Zellmodell, führte zu der Isolierung der zwei Salicylalkoholderivate Salicortin und Tremulacin. Die Strukturaufklärung erfolgte mittels zweidimensionaler NMR-Experimente. Bei diesen beiden Salicinderivaten handelte es sich um Strukturen mit einer 1-Hydroxy-6-oxo-2-cyclohexencarbonsäureester-Partialstruktur. Sie zeigten im ICAM-1 Assay eine dosisabhängige Hemmung der TNF-α induzierten ICAM-1-Expression. Damit wirkten sie in vitro entzündungshemmend. Allerdings ließ sich durch Stabilitätsuntersuchungen unter Assay-Bedingungen nachweisen, dass diese Wirkung nicht auf die Substanzen selbst, sondern auf ihr Abbauprodukt Catechol zurückzuführen war. Sowohl Salicortin als auch Tremulacin wurden unter Assay-Bedingungen fast vollständig abgebaut. Catechol wurde als Abbauprodukt dieser Substanzen mit einer 1-Hydroxy-6-oxo-2-cyclohexencarbonsäureester-Partialstruktur, welche Grundvoraussetzung für die Bildung von Catechol ist, quantifiziert. Das Ausmaß der Aktivität im Assay und damit der entzündungshemmenden Wirkung korrelierte mit dem Abbau zu Catechol.
Im Rahmen der bioaktivitätsgeleiteten Fraktionierung wurde außerdem eine schnelle und einfache Methode zur Quantifizierung der Flavonoide in dem untersuchten Weidenrindenextrakt und seinen Fraktionen per HPLC-DAD entwickelt.
Die in vivo Relevanz des in vitro Abbaus von Salicylalkoholderivaten mit einer 1-Hydroxy-6-oxo-2-cyclohexencarbonsäureester-Partialstruktur zu Catechol wurde daraufhin mit Salicortin als Modellsubstanz überprüft. Nach oraler Gabe von 100 mg/kg KG Salicortin in Wistar-Ratten wurden sowohl Salicylsäure (tmax = 4,0 h; cmax = 10,9 µM; AUC0-8h = 54,4 µM∙h) als auch Catechol (tmax = 0,5 h; cmax = 13,0 µM; AUC0-8h = 35,4 µM∙h) als Metabolite von Salicortin in den enzymatisch aufgearbeiteten Seren der Tiere über einen Zeitraum von acht Stunden detektiert. Catechol wurde im Messbereich der HPLC-DAD nicht als freies Molekül gefunden. Es zeigte sich, dass Catechol nur in konjugierter Form als Phase-II-Metabolit im Serum der Tiere zu finden war. Hierbei lag es hauptsächlich als Sulfat und nur zu einem sehr geringen Teil als Glucuronid vor.
Es wurde außerdem eine pharmakokinetischen Studie beim BfArM und der zuständigen Ethikkommission beantragt. Nach Genehmigung und zustimmender Bewertung der Institutionen, wurde in der Studie über 24 Stunden untersucht, ob Catechol nach Einnahme eines standardisierten Weidenrindenextraktes (entsprach 240 mg Gesamtsalicin) von gesunden Freiwilligen im Serum dieser Probanden zu finden war. Eine enzymatische Aufarbeitungs- und Quantifizierungsmethode für die HPLC-DAD von Catechol und Salicylsäure aus menschlichem Serum wurde entwickelt und validiert. Diese Methode wurde ebenfalls für die Auswertung der oben genannten Rattenseren übernommen, da die Selektivität und die Wiederfindung aus beiden Matrices sehr gut vergleichbar waren. Catechol (tmax = 1,2 h; cmax = 13,3 µM; t1/2 = 2,5 h; AUC0-∞ = 60,8 µM∙h) und Salicylsäure (tmax = 2,7 h; cmax = 24,5 µM; t1/2 = 2,4 h; AUC0-∞ = 127,8 µM∙h) wurden in den enzymatisch aufgearbeiteten Seren der Probanden quantifiziert. Auch hier wurde Catechol nur als Konjugat, hauptsächlich als Sulfat und nur in äußerst geringen Mengen als Glucuronid detektiert.
Beide in vivo Studien zeigten erstmalig, dass Catechol sowohl im Tier als auch im Mensch ein Abbauprodukt und Metabolit von Salicylalkoholderivaten mit einer 1-Hydroxy-6-oxo-2-cyclohexencarbonsäureester-Partialstruktur ist. Für Catechol wurden in verschiedenen in vitro Modellen entzündungshemmende Eigenschaften beschrieben. Damit kann Catechol als ein neues Wirkprinzip der Weidenrinde angesehen werden.
Der entzündungshemmende Einfluss von Catechol gegenüber Salicylsäure als Metabolit von Salicortin wurde in Ratten durch die perorale Gabe von Salicortin im Vergleich zu äquimolaren Mengen Salicin untersucht. Der Einfluss auf die Expression verschiedener proinflammatorischer Zytokine sowie Marker des oxidativen Stresses wurde in der Carrageen-induzierten Entzündung im „Six-day old air pouch Modell“ untersucht. Der zusätzliche Effekt von Catechol zur Salicylsäure war am deutlichsten bei der Hemmung der Myeloperoxidase-Aktivität im Exsudat, ein Marker des oxidativen Stresses. Außerdem wurde die Expression des Zytokins Interleukin 6 im Exsudat durch die Applikation von Salicortin stärker gehemmt als durch Salicin. Bei allen weiteren quantifizierten Entzündungsmediatoren konnte keine Überlegenheit von Catechol festgestellt werden. Salicin konnte stärker als Salicortin die Expression von TNF-α sowohl im Exsudat als auch im Plasma reduzieren.
Ein Phase-II-Metabolit von Catechol, das Catecholglucuronid, wurde synthetisiert und in vitro im ICAM-1 Assay auf seine potentiell entzündungshemmenden Eigenschaften getestet. Er zeigte keine Aktivität.
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Catechol als Metabolit bestimmter Salicylalkoholderivate ein zusätzliches entzündungshemmendes Prinzip der Weidenrinde darstellt. Der Kern dieser Ergebnisfindung lag in der Stabilitätskontrolle des Salicortins unter ICAM-1-Assay-Bedingungen. Ohne diese Stabilitätsuntersuchung wäre Salicortin und nicht sein Abbauprodukt Catechol als die aktive Substanz im untersuchten Entzündungsmodell identifiziert worden. Sie führte zudem zu der Frage, ob dieser in vitro Befund auch in vivo eine Relevanz hat und lieferte letztendlich das Ergebnis, dass Catechol ein Metabolit der beschriebenen Sali-cinderivate in der Weidenrinde ist. Damit leistete die vorliegende Arbeit einen Beitrag zur Aufklärung des Wirkprinzips der Weidenrinde.
Translation of the abstract (English)
In various clinical trials and in vivo studies, the analgesic and anti-inflammatory efficacy of willow bark extracts have already been demonstrated. Pharmacokinetic studies revealed that the amount of salicylic acid as the active metabolite of salicylic alcohol derivatives cannot explain the extent of effectiveness in clinical trials. In this thesis, the pharmacological effects of salicylic ...
Translation of the abstract (English)
In various clinical trials and in vivo studies, the analgesic and anti-inflammatory efficacy of willow bark extracts have already been demonstrated. Pharmacokinetic studies revealed that the amount of salicylic acid as the active metabolite of salicylic alcohol derivatives cannot explain the extent of effectiveness in clinical trials. In this thesis, the pharmacological effects of salicylic alcohol derivatives besides their degradation to salicylic acid were investigated in order to discover new active principles of willow bark.
A bioguided fractionation using the ICAM-1 assay as anti-inflammatory cell culture model yielded in the isolation of the two salicylic alcohol derivatives salicortin and tremulacin. Structure elucidation was performed by two-dimensional NMR experiments. Both salicin derivatives contain a 1-hydroxy-6-oxo-2-cyclohexencarboxylate partial-structure. In the ICAM-1 assay, they inhibited the TNF-α induced ICAM-1 expression both in a dose-dependent manner. Thus, they showed anti-inflammatory properties in vitro. However, stability control under assay conditions revealed that the activity in the ICAM-1 assay was not due to salicortin and tremulacin but caused by their degradation product catechol. Salicortin as well as tremulacin degraded almost completely under assay conditions. Catechol was quantified as degradation product of these substances with a 1-hydroxy-6-oxo-2-cyclohexencarboxylate partial structure which is the prerequisite for the formation of catechol. The extent of the degradation to catechol correlated with the activity in the ICAM-1 assay and therefor also with the antiphlogistic activity.
As part of the bioguided fractionation, a simple and rapid quantification method for the flavonoid content in the willow bark extract and its fraction for HPLC-DAD was developed.
The in vivo relevance of the in vitro degradation of these salicylic alcohol derivatives to catechol was studied. Salicortin was used as model substance for structures containing a 1-hydroxy-6-oxo-2-cyclohexencarboxylate partial structure. After oral administration of 100 mg/kg bw salicortin in wistar-rats, salicylic acid (tmax = 4,0 h; cmax = 10,9 µM; AUC0-8h = 54,4 µM∙h) as well as catechol (tmax = 0,5 h; cmax = 13,0 µM; AUC0-8h = 35,4 µM∙h) were quantified as metabolites of salicortin. Samples were enzymatically processed and the studied was performed over a period of 8 hours. Catechol could not be found as a free molecule by HPLC-DAD. It turned out that catechol could only be found as Phase-II-conjugates in the serum of the animals. The main metabolite was the catechol sulfate whereas the catechol glucuronide was only found in minor amounts.
Furthermore, a pharmacokinetic study in humans was applied at the Ethics Committee of the Bavarian Medical Association and by the Federal Institute of Drugs and Medical Devices (BfArM). After successful approval, it was investigated whether catechol could be found after ingestion of a standardized Willow bark extract (corresponding to 240 mg total salicin) in the serum of healthy volunteers over 24 hours. An enzymatic processing and quantification method for catechol and salicylic acid in human serum samples was developed and validated. This method was also adopted for the quantification in the abovementioned rat serum samples since the selectivity and recovery was very similar in these two matrices. Catechol (tmax = 1,2 h; cmax = 13,3 µM; t1/2 = 2,5 h; AUC0-∞ = 60,8 µM∙h) and salicylic acid (tmax = 2,7 h; cmax = 24,5 µM; t1/2 = 2,4 h; AUC0-∞ = 127,8 µM∙h) were quantified in the enzymatic processed serum samples of the volunteers. As observed before in the animal study, catechol could only be found as Phase-II-conjugates. The main metabolite was again the catechol sulfate whereas the catechol glucuronide was only found in minor amounts.
Both in vivo studies demonstrated for the first time that catechol is a metabolite of salicylic alcohol derivatives containing a 1-hydroxy-6-oxo-2-cyclohexencarboxylate partial structure in animals as well as in humans. For catechol, different anti-inflammatory mechanisms in vitro have already been described in the literature. Thus, Catechol can be considered as a new active principle of Willow bark.
The anti-inflammatory influence of catechol vs. salicylic acid as metabolites of salicortin was investigated in rats via oral administration of salicortin in comparison to oral administration of equimolar amounts of salicin. The effect on the expression of different proinflammatory cytokines and marker of oxidative stress was studied in the carrageen-induced inflammation in the ‘six-day old air pouch model’. Pharmakological effects which could be traced back on the formation of catechol were most significant in inhibiting the activity of MPO, a marker of oxidative stress. Furthermore, after salicortin application, the expression of the cytokine IL-6 in the exudate was reduced more than after salicin application. Concerning other quantified parameters of inflammations, no superiority of salicortin over salicin could be determined. Salicin reduced more effectiyely the TNF-α-expression in the exudate and in the plasma of the animals than it was observed for salicortin.
Catechol-glucuronide, a Phase-II-metabolite of Catechol, was synthesized and tested in vitro in the ICAM-1 assay to determine its potential anti-inflammatory properties. However, it did not show any activity.
This thesis demonstrated that catechol as metabolite of certain salicylic alcohol derivatives represents an additional anti-inflammatory prinicple of Willow bark. It contributed to the elucidation of the mechanisms of action of Willow bark. Without the stability control under ICAM-1-assay-conditions, the substances salicortin and tremulacin instead of their degradation product catechol would have been identified as active substances. Due to the results of the stability control, these in vitro findings were also investigated for their in vivo relevance. The findings underline the importance of determining the stability of substances in in vitro experiments and to look for active metabolites in vivo.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 01:44
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