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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-291173
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.29117
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 5 December 2013 |
| Referee: | Prof. Dr. Jörg Heilmann |
| Date of exam: | 8 November 2013 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical Biology (Prof. Heilmann) |
| Keywords: | Hypericum empetrifolium, Acylphloroglucinols, NMR guided fractionation, anti-angiogenic activity, Chemotaxonomy |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 580 Botanical sciences 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 29117 |
Abstract (German)
Hypericum gehört mit etwa 450 Arten zu einer der größten Gattungen innerhalb der Ordnung der Malpighiales. Verschiedene Botaniker, darunter auch N.K.B. Robson, haben eine Einteilung der Arten in insgesamt 36 Sektionen vorgenommen. Die in der vorliegenden Arbeit untersuchte Art Hypericum empetrifolium gehört neben fünf weiteren Arten zur Sektion 19 Coridium und wird in Griechenland und der Türkei ...
Abstract (German)
Hypericum gehört mit etwa 450 Arten zu einer der größten Gattungen innerhalb der Ordnung der Malpighiales. Verschiedene Botaniker, darunter auch N.K.B. Robson, haben eine Einteilung der Arten in insgesamt 36 Sektionen vorgenommen. Die in der vorliegenden Arbeit untersuchte Art Hypericum empetrifolium gehört neben fünf weiteren Arten zur Sektion 19 Coridium und wird in Griechenland und der Türkei volksmedizinisch unter anderem gegen Magengeschwüre und zur Wundheilung eingesetzt. Es konnten bereits anti-oxidative, anti-inflammatorische als auch zytotoxische sowie anti-bakterielle Aktivitäten für vorwiegend methanolische Extrakte nachgewiesen werden. Neben einigen analytischen Arbeiten zur Zusammensetzung des ätherischen Öls sowie dem Gehalt an Flavonoiden bzw. den Naphthodianthronen Hypericin und Pseudohypericin ist die Art phytochemisch kaum untersucht.
In der vorliegenden Arbeit konnten 23 Acylphloroglucinolderivate per DC- aber insbesondere NMR-geleiteter Fraktionierung mittels Flash-Chromatographie an Kieselgel und RP-18, sowie präparativer HPLC an RP-18 aus einem Petrolether-Extrakt aus den oberirdischen Teilen von H. empetrifolium isoliert werden. Die Strukturaufklärung erfolgte mit Hilfe von 1D und 2D-NMR-spektroskopischen als auch hochaufgelösten massenspektrometrischen Daten. Bei den Verbindungen handelt es sich um mono-, bi-, tri- und polyzyklische Phloroglucinole, die durchweg eine aliphatische Acyl-Seitenkette besitzen. Die Monozyklen (1-9) waren bis auf die O-prenylierte Substanz 6 allesamt C-geranyliert, wobei Empetrifelixin A-D (1-4) und Empetrikajaforin (5) ungewöhnliche Terpen-Addukte darstellen, bei denen ein Limonen bzw. Bornan-Rest mit einer Sauerstofffunktion des Phloroglucinol-Gerüstes verknüpft ist. Darüber hinaus konnten drei trizyklische Verbindungen mit einer Xanthen-Struktur (Empetriferdinan A und B, Empetriferdinol, 18-20) sowie drei polyzyklische Acylphloroglucinole (Empetrifranzinan A-C, 21-23) mit einem Citran-Grundgerüst isoliert werden. Den bizyklischen Chroman- und Chromen-Derivaten (10-17) könnte für die Sektion 19 eine Rolle als ‚Biomarker‘ zukommen, da ähnliche Verbindungen in allen der bisher untersuchten Arten von Coridium nachgewiesen werden konnten.
Hyperforin, das wohl bekannteste polyprenylierte Acylphloroglucinol aus Hypericum perforatum kann als einer der wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffe im Hinblick auf die antidepressive Wirkung des Johanniskrautes angesehen werden. Darüber hinaus konnten in den letzten Jahren anti-angiogene Effekte auf humane Endothelzellen sowohl in vitro als auch in vivo beschrieben werden. Die Hemmung der Angiogenese spielt mittlerweile eine wichtige Rolle in der Behandlung verschiedener Tumorerkrankungen sowie in der Therapie der altersbedingten Makuladegeneration (AMD).
In der vorliegenden Arbeit wurden die in ausreichender Menge isolierten Verbindungen zunächst auf eine mögliche anti-proliferative in vitro Aktivität gegen humane mikrovaskuläre Endothelzellen (HMEC-1) getestet. Die ermittelten IC50-Werte lagen im Konzentrationsbereich von 6 bis 30 µM. Die beiden aktivsten Verbindungen, Empetrifelixin A (1) und Empetrifelixin B (2) zeigten in einem weiteren in vitro-Assay einen hemmenden Effekt auf die Migration der HMEC in den Konzentrationen 1, 10 und 20 µM.
Für die weitere Testung wurde Substanz 8 verwendet, welche in wesentlich höherer Menge aus dem Extrakt isoliert werden konnte und im Proliferations-Assay eine ähnlich gute Aktivität wie 1 und 2 zeigte. In einem Tube-formation Assay hemmte die Verbindung in den Konzentrationen 6,25 und 12,5 µM die Fähigkeit der Endothelzellen, sogenannte ‚Tubes‘ auf einer extrazellulären Matrix (MatrigelTM) auszubilden. Die Ausformung kapillarähnlicher Strukturen war bis auf 50% reduziert, wobei die Viabilität der Zellen in einem MTT-Assay überprüft und offensichtlich nicht beeinflusst wurde. Als Kontrolle diente Phloroglucin (1,3,5-Trihydroxybenzol), welches die Bioaktivität von endothelialen Vorläuferzellen zu hemmen in der Lage war (Kwon et al. 2012). In der vorliegenden Arbeit allerdings konnte im Konzentrationsbereich von 6,25 bis 50 µM keine Auswirkung weder auf die Proliferation noch die Tube-formation von HMEC-1 festgestellt werden.
In weiteren in vivo-Assays müssen diese ersten Ergebnisse der Acylphloroglucinolderivate aus Hypericum empetrifolium bestätigt werden, um anschließend den Mechanismus der anti-angiogenen Aktivität der Substanzen näher zu beleuchten.
Darüber hinaus sind systematische phytochemische Untersuchungen, insbesondere der Arten der Sektion 19 notwendig, um die in der vorliegenden Arbeit angedeuteten chemotaxonomischen Zusammenhänge zu bestätigen.
Translation of the abstract (English)
The genus Hypericum nearly comprises 450 species and is one of the largest genera of the order Malpighiales. Several botanists, including N.K.B. Roboson, have structured the genus into 36 sections. Together with five other species, Hypericum empetrifolium, the object of the present study, belongs to section 19 Coridium and is part of the traditional medicine in Greece and Turkey for healing ...
Translation of the abstract (English)
The genus Hypericum nearly comprises 450 species and is one of the largest genera of the order Malpighiales. Several botanists, including N.K.B. Roboson, have structured the genus into 36 sections. Together with five other species, Hypericum empetrifolium, the object of the present study, belongs to section 19 Coridium and is part of the traditional medicine in Greece and Turkey for healing gastric ulcers and to speed wound-healing. Methanolic extracts show antioxidative, antiinflammatory as well as cytotoxic and antibacterial activity. Furthermore, very little is known about the species, only the composition of the essential oil and the content of flavonoids and naphthodianthrones, namely hypericin and pseudohypericin have been investigated yet.
In this study, TLC- and, in particular, NMR-guided fractionation of the petroleum ether extract of the aerial parts of H. empetrifolium led to the isolation of 23 acylphloroglucinol derivatives via flash chromatography on silicagel and RP-18, as well as semi-preparative HPLC (RP-18). The structure elucidation was performed with 1D, 2D NMR and MS techniques. The isolated molecules show mono-, bi-, tri- and polycyclic structures with an aliphatic side chain in general. All monocyclic compounds (1-9) contain a geranyl moiety, except 6 which is O-prenylated. Empetrifelixin A-D (1-4) and Empetrikajaforin (5) represent uncommon, hitherto unknown terpene adducts of limonene- and bornane-bearing acylphloroglucinols. In addition to three tricyclic xanthen derivatives (Empetriferdinan A and B, Empetriferdinol, 18-20), three polycyclic compounds (Empetrifranzinan A-C, 21-23) with an unusual citran skeleton were isolated. The bicyclic chromane and chromene derivatives (10-17) might act as ‘biomarkers’ for section 19 due to the fact that in every other species of Coridium, which has been investigated yet, similar compounds were found.
Hyperforin, one of the most common polyprenylated acylphloroglucinol, is a major antidepressant component of St. John’s Wort (Hypericum perforatum L.). Moreover, antiangiogenic effects on human endothelial cells in vitro and in vivo have been unveiled in the last decades. The inhibition of angiogenesis meanwhile plays an important role in the therapy of tumors and age-related macular degeneration.
In this study, the compounds isolated in sufficient amounts showed antiproliferative in vitro activity on human microvascular endothelial cells (HMEC-1) with IC50 values in the range 6 to 30 µM. Empetrifelixin A (1) and B (2) also inhibited the migration of endothelial cells in low micromolar concentrations.
For further testing, compound 8 was used due to higher quantity and its similar anti-proliferative activity in comparison with 1 and 2. In the tube formation assay, 8 showed inhibitory effects at 6.25 and 12.5 µM on endothelial cells concerning their capability to build capillary structures on extracellular matrix (MatrigelTM). Capillary-like tube formation of HMEC-1 was reduced to 50%, whereas the viability was not influenced. Phloroglucinol (1,3,5-trihydroxybenzene) served as control, since inhibition of bioactivity of endothelial progenitor cells (EPCs) was reported (Kwon et al. 2012). However, in this study, phloroglucinol did not show any effect on human microvascular endothelial cells from 6,25 to 50 µM neither in proliferation assay nor in tube formation assay.
These first hints of antiangiogenic activity of acylphloroglucinol derivatives from Hypericum empetrifolium on endothelial cells have to be confirmed in further in vivo assays as well as the need to highlight the influence on cell signaling pathways.
To furnish proof for the chemotaxonomic correlationship between sections of the genus Hypericum, as indicated in this study, all other species of section 19 should be subjected to further systematic phytochemical investigations.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 01:39
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