| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen mit Print on Demand (9MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-295572
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.29557
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 19 Januar 2015 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Frank Sprenger |
| Tag der Prüfung: | 5 Februar 2014 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Cell Cycle Control > Prof. Dr. Frank Sprenger |
| Stichwörter / Keywords: | Rca1, F-box, Dacapo, G1-S Übergang |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 29557 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Rca1 ist ein wichtiger Inhibitor für die Ubiqutin-E3-Ligase APC/C mit dem Aktivatorproteine Fzr (Fizzy-related, ortholog zu Cdh1), vor allem in der G2-Phase des Zellzyklus, und ermöglicht die Akkumulati-on von Cyclinen für die darauffolgende Mitose. Embryonen, die die rca1-Allele rca1[2] und rca1[C1474] tragen, arretieren deshalb im Zellzyklus 16 und können nicht in die Mitose 16 eintreten. Durch ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Rca1 ist ein wichtiger Inhibitor für die Ubiqutin-E3-Ligase APC/C mit dem Aktivatorproteine Fzr (Fizzy-related, ortholog zu Cdh1), vor allem in der G2-Phase des Zellzyklus, und ermöglicht die Akkumulati-on von Cyclinen für die darauffolgende Mitose. Embryonen, die die rca1-Allele rca1[2] und rca1[C1474] tragen, arretieren deshalb im Zellzyklus 16 und können nicht in die Mitose 16 eintreten. Durch Überexpression von Rca1 und Rca1 mit deletierter F-box (Rca1ΔF-box) konnte dieser Phänotyp komplementiert werden. In dieser Arbeit wurde die genomische Region von rca1 kloniert, um die Analyse mit endogenen Mengen von Rca1 und Rca1 ohne F-box weiterzuführen. Die Expression von Rca1ΔF-box unter Kontrolle dieser Region konnte den Phänotyp jedoch im Vergleich zu der Überexpression nicht komplementieren. Rca1 interagiert mit SkpA und ist deshalb vermutlich Teil eines SCF-Komplexes. Ein mögliches Substrat ist Dacapo, ein Cyclin E/Cdk2 Inhibitor. Aus diesem Grund wurden rekombinante Fliegenstämme hergestellt, die neben den rca1-Allelen das dap6-Allel auf dem zweiten Chromosom tragen. Dabei zeigen sich unterschiedliche Phänotypen für die beiden rca1-Allele rca1[2] und rca1[C1474]. Die kodierende Region von rca1[2] enthält einen Austausch der Aminosäure A344T unmittelbar vor der Zinkbinderegion, die für die APC/C-Inhibition notwendig ist. rca1[2] dap[6] Embryonen durchlaufen wie dap[6] mutante Embryonen einen zusätzlichen 17. Zellzyklus. In der kodierenden Region von rca1[C1474] ist ein Aminosäureaustausch innerhalb des F-box-Motivs vorhanden. rca1[C1474] dap[6] mutante Embryonen zeigen den rca1-mutanten Phänotyp und arretieren in der G2-Phase im 16. Zellzyklus. Die F-box-Funktion ist also bei endogenen Rca1-Mengen am G2-M-Übergang des 16. Zellzyklus notwendig.
Die Überexpression von Rca1 während der Augenentwicklung führt zu ektopischen S-Phasen und einem rauen Augenphänotyp. Dieser Phänotyp zeigt einen ebenfalls F-box-abhängigen Effekt am G1-S-Übergang. Durch die Lebendzellbeobachtung von S2R+-Zellen, die 4xFLAG-Rca1 überexprimieren, konnte gezeigt werden, dass diese Zellen vorzeitig in die G1-Phase eintreten. Da Rca1 vermutlich einen SCF-Rca1-Komplex ist und den Abbau eines negativen Regulators des G1-S-Übergangs vermitteln könnte, wurden durch Überexpression verschiedener 4xFLAG-Epitop-markierter Rca1-Derivate und einem in vivo APC/C-Inhibitionsassay, der Einfluss verschiedener funktioneller Domänen auf den G1-S-Übergang überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass die Funktion von Rca1 am G1-S-Übergang sowohl durch die Funktion von Rca1 in einem SCF-Rca1-Komplex als auch durch die APC/C-Fzr-Inhibition zustande kommen könnte.
Es wurde außerdem durch die Überexpression verschiedener 4xFLAG-Rca1-Derivate der Einfluss auf die Stabilität von GFP-markiertem Dacapo untersucht, um festzustellen, ob Dacapo ein Substrat des SCF-Rca1-Komplexes sein könnte. Es konnte eine F-box-abhängige Verringerung von GFP-Dacapo um ca. 50 % im Durchflusszytometer beobachtet werden. Außerdem konnte der durch Überexpression von GFP-Dacapo induzierte G1-Arrest F-box-abhängig durch die Überexpression von 10xHA-Rca1 aufge-hoben werden. Bei der Abreicherung von Rca1 durch RNAi konnte außerdem eine Stabilisierung von GFP-Dacapo erzielt werden.
Dacapo kommt demnach als Substrat eines SCF-Rca1-Komplexes in Frage. Dieser Komplex könnte sowohl in die Regulation des APC/C am G2-M-Übergang involviert sein, indem er die Aktivität von Cyclin E/Cdk2 als Regulator des APC/C neben Cyclin A/Cdk1 und Rca1 beeinflusst, als auch am G1-S-Übergang, wo er den Abbau von Dacapo als negativen Regulator des G1-S-Übergangs vermitteln könnte.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Rca1 is an important inhibitor of the ubiquitin E3-ligase APC/C with the activator Fzr (Fizzy-related, a homolog to Cdh1), mainly in the G2-phase of the cell cycle. It enables the accumulation of cyclins for the subsequent mitosis. Embryos that carry the rca1-alleles rca1[2] and rca1[C1474] arrest in cell cycle 16 and cannot enter mitosis 16th. This phenotype could be complemented through the ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Rca1 is an important inhibitor of the ubiquitin E3-ligase APC/C with the activator Fzr (Fizzy-related, a homolog to Cdh1), mainly in the G2-phase of the cell cycle. It enables the accumulation of cyclins for the subsequent mitosis. Embryos that carry the rca1-alleles rca1[2] and rca1[C1474] arrest in cell cycle 16 and cannot enter mitosis 16th. This phenotype could be complemented through the overexpression of Rca1 or Rca1 with a deleted F-box-motif. Here, the genomic region of rca1 was cloned and introduced into flies. This region was able to rescue the rca1-mutant phenotype. However, the expression of Rca1ΔF box under the control of this region could not complement this phenotype.
Rca1 interacts with SkpA and therefore could be part of an SCF-complex. The Cyclin E/Cdk2 inhibitor Dacapo could be a substrate of this complex. Hence, recombinant fly strains were produced which carry apart from the rca1-alleles the dap[6] allele on the second chromosome. For these recombinants different phenotypes for the two rca1-alleles could be observed. rca1[2] dap[6] embryos show the phenotype of dap6 mutants and undergo an additional 17th cell cycle, whereas rca1[C1474] dap[6] mutant embryos arrested in the G2 phase of the cell cycle 16th like rca1-mutants. The coding region of rca1[2] carries the exchange of an amino acid at the position A344T proximately to the zinc binding region, whereas there is a amino acid exchange in the F-box-domain in the coding region of rca1[C1474]. Thus, the F-box-function is needed at endogenous levels at the G2-M-transition in cell cycle 16.
Overexpression of Rca1 during eye development leads to ectopic S-phase and a rough eye phenotype. This phenotype is dependent on the F-box-motif and since the interaction of Rca1 with SkpA, a subunit of the SCF-E3-ligase is also F-box dependant, Rca1 has a further F-box-function at the G1-S-transition. By the use of live cell imaging it could be shown that the overexpression of 4xFLAG-Rca1 in S2R+ cells accelerates the G1-S-transition and the cells enter earlier into the S-phase. Through the overexpression of various 4xFLAG-epitope labeled Rca1 derivates and an in vivo APC/C-inhibition assay, it could also be shown that the function of Rca1 the G1 -S transition could be fulfilled by another function apart from the direct APC/C-inhibition as part of an SCF-Rca1 complex.
Furthermore it was analyzed whether Dacapo could be a substrate of the SCF-Rca1 complex. For this purpose, various 10xHA-epitope tagged Rca1 derivates were simultaneously overexpressed with GFP-epitope tagged Dacapo. An F-box dependant reduction of GFP-Dacapo amounts to about 50 % could be observed using flow cytometry. Apart from that the G1-arrest induced by the overexpression of GFP-Dacapo in cell culture could be overcome by overexpression 10xHA-Rca1. Furthermore the depletion of Rca1 by RNAi led to a stabilization of GFP-Dacapo. Dacapo therefore could be a sub-strate of an SCF-Rca1 complex, that is on the one hand involved in the APC/C regulation at the G2-M-transition by influencing the activity of Cyclin E/Cdk2 as a regulator of the APC/C apart from Cyclin A/Cdk1 and Rca1. And on the other hand Rca1 could regulate Dacapo as a negative regulator of the G1-S-transition by mediating the degradation of Cyclin E/Cdk2 at the G1-S-transition.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 01:24
Nur für Besitzer und Autoren: Kontrollseite des Eintrags
Downloadstatistik