| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen mit Print on Demand (10MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-297321
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.29732
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 16 März 2015 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Stephan Schneuwly |
| Tag der Prüfung: | 3 Februar 2014 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für experimentelle Medizin und Therapieverfahren Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Zoologie > Entwicklungsbiologie (Prof. Dr. Stephan Schneuwly) |
| Stichwörter / Keywords: | Melanom, disseminierte Tumorzelle, Metastasierung, Wächterlymphknoten, melanoma, disseminated cancer cell, metastasis, sentinel lymph node |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 29732 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Der Nutzen systemischer Therapien beim malignen Melanom ist bis heute zumeist gering. Eine mögliche Ursache ist, dass die disseminierten Zielzellen dieser Therapien molekular schlecht charakterisiert sind. Der Nachweis gestreuter Tumorzellen (DCC) im Wächterlymphknoten stellt in der Diagnostik derzeit einen der wichtigsten prognostischen Faktoren dar. Bereits der immunhistochemische Nachweis ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Der Nutzen systemischer Therapien beim malignen Melanom ist bis heute zumeist gering. Eine mögliche Ursache ist, dass die disseminierten Zielzellen dieser Therapien molekular schlecht charakterisiert sind. Der Nachweis gestreuter Tumorzellen (DCC) im Wächterlymphknoten stellt in der Diagnostik derzeit einen der wichtigsten prognostischen Faktoren dar. Bereits der immunhistochemische Nachweis einzelner Tumorzellen im Lymphknoten gilt als Kriterium für eine systemische Streuung des Primärtumors. Es war das Ziel der vorliegenden Arbeit, einzelne disseminierte Tumorzellen des Melanoms aus Wächterlymphknoten zu isolieren und molekular sowie funktionell zu untersuchen.
Dazu wurde zunächst eine Immunfluoreszenzfärbung zum Nachweis vitaler DCC in Wächterlymphknoten über das membranständige Markermolekül Melanom-assoziiertes-Chondroitin-Sulfat Proteoglykan (MCSP) etabliert und ein Patientenkollektiv auf MCSP+ DCC in Lymphknoten untersucht. Es konnten morphologisch große und kleine MCSP+ Zellen isoliert werden. Bei Verwendung eines anderen Markers, dem Antigen gp100, für den aus der Arbeitsgruppe bereits erste molekulare Daten vorlagen, fand sich hingegen stets ein einheitlicher Phänotyp. Es wurden in dieser Arbeit MCSP+ und gp100+ DCC aus denselben Proben, sowie gp100+ DCC aus vorausgegangenen Studien miteinander verglichen. Die Sensitivität des MCSP-Nachweises wurde an Kontrolllymphknoten gesunder Spender überprüft. In den Kontrollen wurden ausschließlich kleine MCSP+ Zellen detektiert, die mediane Zellzahl und die Detektionsraten in den Kontrollen entsprachen denen der Patientenproben.
Ein Ursprung MCSP+ Zellen aus dem Melanom wurde zunächst über eine PCR-basierte Expressionsanalyse melanozytärer Differenzierungsmarker und für das Melanom beschriebener Stammzell-assoziierter Marker überprüft. Die Marker gp100, MelanA und TRP2 wurden ausschließlich in den MCSP+ Zellen von Melanompatienten exprimiert und kennzeichnen 63 % der großen MCSP+ Zellen und 18 % der kleinen MCSP+ Zellen als maligne Zellen.
Um weitere Aussagen zur Malignität der MCSP+ Zellen zu erhalten, wurde die DNA der isolierten Zellen auf Punktmutationen der Onkogene BRAF und NRAS, sowie durch komparative genomische Hybridisierung (CGH) auf charakteristische Veränderungen hin, untersucht und mit den Befunden der gp100+ DCC verglichen.
Von den untersuchten Patienten teilten 38 % in ihren DCC Punktmutationen nicht zwischen MCSP+ und gp100+ Zellen. Ein Vergleich gepaarter Läsionen aus Primärtumor und Metastasen zeigte ebenfalls eine Heterogenität in 33 % der Patienten. Die CGH-Profile der DCC unterschieden sich zwischen den Zellpopulationen von MCSP und gp100, und zwischen großen und kleinen MCSP+ Zellen. Zellen von N1-Patienten beider Gruppen wiesen eine höhere Anzahl an Aberrationen auf, ebenso morphologisch große MCSP+ Zellen. MCSP+ Zellen trugen in 67 %, gp100+ Zellen in 82 % genomischen Veränderungen. Zudem konnten auch in 53 % der untersuchten kleinen MCSP+ Zellen Veränderungen nachgewiesen werden, was diese als maligne melanozytäre Zellen kennzeichnet.
Die erfolgreiche in vivo Propagation von Tumoren nach subkutaner Injektion einzeln isolierter MCSP+ DCC in immundefizienten NSG-Mäusen, bestätigt deren tumorigenes Potential und ihre Bedeutung als Vorstufen manifestierter Lymphknotenmetastasen.
Der Nachweis gp100+ Melanomzellen war sensitiver als die Routinepathologie und bestätigte frühere Studien der Arbeitsgruppe. Für MCSP+ DCC liegen derzeit finale Aussagen zur Malignität für mehr als 40 % der Zellen vor. Deshalb ist hier derzeit noch keine endgültige Aussage zur Nachweisrate von DCC mit MCSP möglich. Hinsichtlich klinischer Faktoren bestand ein signifikanter Zusammenhang lediglich zwischen einer Ulzeration des Primärtumors und dem Auftreten MCSP+ Zellen im Lymphknoten. Der Nachweis großer MCSP+ Zellen korrelierte negativ mit dem Überleben der Patienten, ebenso die klinischen Parameter histopathologischer Befund des Lymphknotens, Tumordicke und Mutationsstatus. Für die kleinen MCSP+ Zellen konnten keine Zusammenhänge zwischen dem Nachweis und dem Überleben der Patienten oder anderen klinischen Variablen gefunden werden. Hier muss allerdings die relativ kurze Beobachtungszeit der Patienten bis zum Abschluss dieser Arbeit berücksichtigt werden, die im Mittel unter 24 Monaten lag.
Die gewonnenen Ergebnisse machen deutlich, dass die systemische Progression des malignen Melanoms über die Stufen der Erkrankung von der frühen Disseminierung in die Wächterlymphknoten bis zu manifestierten Metastasen einen dynamischen und heterogenen Verlauf zeigt. Diese Heterogenität muss verstärkt bei der Entwicklung neuer individualisierter Therapieansätze berücksichtigt werden. Großen MCSP+ DCC in Wächterlymphknoten kommt aufgrund ihrer Malignität, ihres tumorigenen Potentials und ihrem Einfluss auf das Überleben als Vorstufe der Metastasierung eine entscheidende Bedeutung zu. Kleine MCSP+ Zellen stellen nach den Ergebnissen dieser Arbeit möglicherweise eine im Prozess der Proliferation befindliche Vorstufe der großen Zelle dar.
Die weitere molekulare und funktionelle Charakterisierung der DCC kann Hinweise auf potentielle therapeutische Zielstrukturen liefern. Diese Arbeit kann dazu als ein erster Schritt gesehen werden.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The benefit of systemic therapies for patients with malignant melanoma is still low. One reason is that disseminated cancer cells (DCC) - the targets of these therapies - are not well characterized on a molecular level. The detection of DCC is one of the most important prognostic factors. Even the detection of single DCC in the sentinel lymph node by immunohistochemistry serves as criterion for ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The benefit of systemic therapies for patients with malignant melanoma is still low. One reason is that disseminated cancer cells (DCC) - the targets of these therapies - are not well characterized on a molecular level. The detection of DCC is one of the most important prognostic factors. Even the detection of single DCC in the sentinel lymph node by immunohistochemistry serves as criterion for systemic spreading of the primary tumor. The aim of this work was the isolation of single DCC from sentinel lymph nodes of melanoma patients and their molecular and functional characterization.
Therefore an immunofluorescence staining was established against the cell surface marker molecule melanoma-associated-chondroitin-sulfate-proteoglycan (MCSP) to detect vital DCC in sentinel nodes. Then a patient cohort was screened for MCSP+ DCC in their lymph nodes. It was possible to isolate MCSP+ cells of large and small morphology. For cells detected by another marker - the antigen gp100 - first molecular data were already available in the group. These cells showed a homogeneous morphological phenotype. In the study here MCSP+ and gp100+ cells from the same samples as well as gp100+ cells from previous studies were compared to each other. The sensitivity of the MCSP-staining was tested on control lymph nodes of healthy donors. In the controls only small MCSP+ cells were detected with a similar median cell number and detection rate compared to the patient samples.
The melanocytic origin of MCSP+ cells was first tested by PCR-based expression analysis of melanocytic differentiation markers and known stem cell markers for melanoma. The markers gp100, melanA and TRP2 were only expressed in MCSP+ cells of melanoma patients and marked 63% of the large and 18% of the small MCSP+ cells as malignant.
To get further evidence for the malignancy of MCSP+ cells, the DNA of the isolated cells was screened for point mutations of the oncogenes BRAF and NRAS. Comparative genomic hybridization analysis (CGH) was applied to detect characteristic alterations and to compare them with the results of the gp100+ cells.
From the patients investigated 38 % did not share point mutations between MCSP+ and gp100+ cells. A comparison of paired lesions from primary tumor and metastases showed also heterogeneity in 33 % of the patients. The CGH profiles of DCC differed between cell populations of MCSP and gp100 and between large and small MCSP+ cells. Cells from N1-patients of both groups showed a higher number of aberrations as did MCSP+ cells of large phenotype. MCSP+ cells showed aberrations in 67 % and gp100+ cells in 82 %. Also 53 % of analyzed small MCSP+ cells carried alterations, identifying them as malignant melanocytic cells.
Successful in vivo propagation of tumors after subcutaneous injection of single isolated MCSP+ DCC in immunodeficient NSG mice proved their tumorigenic potential and their importance as precursors of manifested lymph node metastases.
Detection of gp100+ melanoma cells was more sensitive as routine pathology and corroborated former studies of the group. Conclusive evidence for the malignancy of MCSP+ DCC is currently proven for more than 40 % of the cells. Therefore a final statement on the detection rate of DCC with MCSP is not possible at the moment. Of the clinical factors only ulceration of the primary tumor and detection of MCSP+ cells in the lymph node showed a significant correlation. The detection of large MCSP+ cells showed a negative correlation with the survival of the patients as did the histopathologic result of the lymph node, the tumor thickness and the mutational status of the patient. Small MCSP+ cells showed no correlation between detection of DCC and survival of the patient or any other clinical parameters. It has to be taken into consideration that the observation period of the patients until the end of this work was relatively short, in median lower than 24 months.
The results show that the systemic progression of malignant melanoma over all steps of the disease from early dissemination in the sentinel nodes to manifest metastases is a dynamic and heterogeneous process. This heterogeneity has to be considered when developing new individualized therapeutic assays. Large MCSP+ DCC in sentinel nodes do already show their importance as precursors of metastases due to their malignancy, their tumorigenic potential and their impact on the survival of the patients. Small MCSP+ cells may be, according to the findings of this work, precursors of large cells which are in a certain process of proliferation. Further molecular and functional characterization of DCC can provide hints on potential therapeutic structures. This work is a first step into that direction.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 01:18
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