Meyer, Carolin
(2014)
Synthesis and structure-activity relationships of inhibitors of bacterial hyaluronidase: An approach to obtain compounds with drug-like properties.
PhD, Universität Regensburg.
Date of publication of this fulltext: 29 Apr 2014 16:15
Abstract (English)
Hyaluronidases are enzymes that predominantly degrade hyaluronan, a major constituent of the extracellular matrix. They can be ubiquitously found throughout the animal kingdom and have been isolated from a large number of different organs and animal venoms. Additionally, hyaluronidases are produced by bacteria and fungi. In case of pathogenic bacteria and animal venoms, the hyaluronidases act as ...
Abstract (English)
Hyaluronidases are enzymes that predominantly degrade hyaluronan, a major constituent of the extracellular matrix. They can be ubiquitously found throughout the animal kingdom and have been isolated from a large number of different organs and animal venoms. Additionally, hyaluronidases are produced by bacteria and fungi. In case of pathogenic bacteria and animal venoms, the hyaluronidases act as spreading factors. They cause local tissue damage to facilitate the diffusion of pathogens and toxins, respectively. Inhibitors of the hyaluronidases are required as pharmacological tools to further investigate their physiological and pathophysiological roles of these enzymes.
Previously, we identified hyaluronidase inhibitors among lipophilic vitamin C, indole, and benzoxazole derivatives. Due to the lack of drug-like properties and high plasma protein binding, such substances are considered inappropriate for in vivo studies. The goal of this thesis was the design, synthesis, identification, and pharmacological characterization of novel low-molecular weight inhibitors of the bacterial hyaluronidase SagHyal4755 with improved drug-like properties.
In a first attempt, several commercially available drugs, especially non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), were investigated for inhibitory activity on the hyaluronate lyase SagHyal4755 and the bovine testis hyaluronidase (BTH). All tested substances were inactive or only weakly active on BTH, suggesting inactivity of these compounds at the corresponding human enzyme, the PH 20 hyaluronidase. In contrast to the mammalian enzyme, the bacterial hyaluronidase was inhibited by several compounds. The salicylate diflunisal (IC50 (SagHyal4755) = 195 µM) was identified as a putative lead compound for the design and synthesis of chemically related inhibitors of SagHyal4755 with improved drug-like properties.
The scaffold of diflunisal was modified by introduction of a variously substituted aryl rings via Suzuki-Miyaura coupling led to potent inhibitors, for example 1,1’:3’,1’’-terphenyl-4-carboxylic acid and 4-hydroxy-1,1’:4’,1’’-terphenyl-3-carboxylic acid which revealed IC50 values of about 30 µM on SagHyal4755 corresponding to a 6-fold increased potency compared to the lead diflunisal. However, inhibitors for the second bacterial hyaluronidase, SpnHyl, were not found among the diflunisal analogs, indicating differences between the binding pockets of these related enzymes.
In a second synthetic approach, analogs of 6,7-dichloro-1H-indoles and 5-hydroxy-1H-indoles were synthesized. Whereas the investigated compounds showed only weak or no inhibition on both the bovine testicular hyaluronidase (BTH) and the bacterial hyaluronidase SpnHyl, IC50 values in the two-digit micromolar range were determined on SagHyal4755. 6,7 Dichloro-1-(4-chlorobenzyl)-3-methyl-1H-indole-2-carboxylic acid was the most potent inhibitor from the series (IC50 = 16 µM).
In general, the potency of both, diflunisal- and indole-type hyaluronidase inhibitors, is strongly dependent on the presence of a negatively charged carboxylic group and chloro substituents as well as the overall lipophilicity of the compounds. The combination of these structural features resulted in inhibitory activity on SagHyal4755 in the lower two-digit micromolar range.
In search of bioisosteric replacements of the indole scaffold, a small series of eight 2 phenylindolizine derivatives, with and without carboxylic acid moieties, was synthesized. Except for 4-(6-cyanoindolizin-2-yl)benzoic acid (IC50 = 56 µM), these compounds showed very weak or no inhibition of the streptococcal hyaluronidase SagHyal4755. All synthesized compounds were devoid of inhibitory activity on BTH.
A subproject of this thesis focused upon the characterization of venoms from two different snake species, Bitis arietans (viper) and Naja siamensis (cobra), with regard to their hyaluronidase activity. Both venoms contain hyaluronidases with a molecular weight between 45 kDa and 65 kDa, which showed their maximum activity at acidic pH values (pH 4-7). The investigation of four selected compounds for inhibition of the two snake venom hyaluronidases revealed very weak or no inhibition. Since the pure reptile hyaluronidases were not available for more detailed investigations, lack of activity at these reptile enzymes cannot be ruled out. However, the high protein content in the raw venoms has to be taken into account as well. This assumption is supported by the high plasma protein binding of the tested compounds, as determined by an HPLC based method.
Taken together, substances derived from three different scaffolds were identified as two-digit micromolar inhibitors of the hyaluronate lyase SagHyal4755, but not of the bacterial hyaluronidase SpnHyl, the bovine testis hyaluronidase (BTH), and the snake venom hyaluronidases.
Translation of the abstract (German)
Hyaluronidasen sind Enzyme, die Hyaluronsäure, einen Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix, abbauen. Sie kommen ubiquitär im gesamten Tierreich vor und konnten aus einer Reihe verschiedener Organe und aus Tiergiften isoliert werden. Des Weiteren werden Hyaluronidasen von Bakterien und Pilzen produziert. Die Hyaluronidasen aus Tiergiften (z.B. Schlangen- oder Bienengift) und aus pathogenen ...
Translation of the abstract (German)
Hyaluronidasen sind Enzyme, die Hyaluronsäure, einen Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix, abbauen. Sie kommen ubiquitär im gesamten Tierreich vor und konnten aus einer Reihe verschiedener Organe und aus Tiergiften isoliert werden. Des Weiteren werden Hyaluronidasen von Bakterien und Pilzen produziert. Die Hyaluronidasen aus Tiergiften (z.B. Schlangen- oder Bienengift) und aus pathogenen Bakterien fungieren hauptsächlich als „spreading factors“: Sie bauen die Hyaluronsäure in der extrazellulären Matrix ab und erleichtern so die Ausbreitung der Toxine bzw. Pathogene im Gewebe des Wirts. Inhibitoren sind daher in zweierlei Hinsicht von Interesse: Zum einen können sie als pharmakologische Werkzeuge dienen, um die (patho-)physiologischen Rollen dieser Enzyme weiter zu untersuchen. Zum anderen könnten sie als Adjuvantien die antibiotische Therapie gegen resistente Keime verbessern.
Zu den potentesten bisher bekannten Inhibitoren für die bakterielle Hyaluronidase SagHyal4755 gehören lipophile 6-O-acylierte Vitamin C Derivate, Indole und Benzoxazole. Die hohe Lipophilie dieser Substanzen führt zu hoher Plasmaproteinbindung und schlechter Wasserlöslichkeit, so dass die Anforderungen bezüglich „arzneistoffartiger Eigenschaften“ („drug-like properties“) für In-vivo- Untersuchungen nicht erfüllt werden. Daher war das Ziel dieses Projektes, der Entwurf, die Synthese, Identifizierung und pharmakologische Charakterisierung neuer niedermolekularer Wirkstoffe mit verbesserten „drug-like properties“ zur Hemmung der bakteriellen Hyaluronidase.
Zunächst wurden eine Reihe bekannter, kommerziell verfügbarer Arzneistoffe, insbesondere nichtsteroidale Antiphlogistika (NSAIDs), ausgewählt und auf Inhibition an der bakteriellen Hyaluronidase SagHyal4755 und der bovinen testikulären Hyaluronidase (BTH) getestet. Am bovinen Enzym waren die untersuchten Arzneistoffe inaktiv oder allenfalls schwach wirksam. Dies lässt vermuten, dass sich diese Substanzen an dem der BTH entsprechenden humanen Enzym PH-20 ebenso verhalten. Die bakterielle Hyaluronidase hingegen wurde von einigen der untersuchten Substanzen gehemmt. Das Salicylsäure-Derivat Diflunisal (IC50 (SagHyal4755) = 195 µM) wurde als Leitstruktur für die Entwicklung neuer Inhibitoren identifiziert.
Am Grundgerüst des Diflunisal-Moleküls wurden verschiedene Modifikationen vorgenommen, die hauptsächlich in der Einführung verschieden substituierter Arylringe bestanden. Mit Hilfe der Suzuki-Miyaura Kreuzkupplung konnten eine Reihe neuer Inhibitoren synthetisiert werden, die im Vergleich zu Diflunisal zum Teil einen ca. 6-fach niedrigeren IC50-Wert an der bakteriellen Hyaluronidase aufweisen. Die beiden Verbindungen 1,1:3‘,1‘ Triphenyl-4-carbonsäure (UR-CM67) und 4-Hydroxy-1,1:4‘,1‘-triphenyl-3-carbonsäure (UR-CM70) erreichten IC50-Werte um 30 µM an der Hyaluronatlyase SagHyal4755. Dagegen wurden keine Inhibitoren für die zweite bakterielle Hyaluronidase aus Streptococcus pneumoniae (SpnHyl) unter den Diflunisal-Analoga identifiziert.
In einem zweiten Ansatz wurden 6,7-Dichlor-1H-indole und 5-Hydroxy-1H-indole synthetisiert. Während die meisten dieser Verbindungen nur schwache oder keine Hemmung an der bovinen testikulären (BTH) und der bakteriellen Hyaluronidase SpnHyl zeigten, erreichten sie zum Teil an der Lyase SagHyal4755 IC50-Werte im zweistellig mikromolaren Bereich. 6,7 Dichlor-1-(4-chlorbenzyl)-3-methyl-1H-indol-2-carbonsäure war die potenteste dieser Verbindungen (UR-CM197, IC50 = 16 µM).
Es wurde ein bioisosterer Ersatz des Indol-Gerüstes durchgeführt und eine kleine Serie von 2 Phenylindolizin-Derivaten synthetisiert. Mit Ausnahme von 4-(6-Cyanoindolizin-2 yl)benzoesäure (IC50 = 56 µM) zeigten die Verbindungen keine oder nur schwache Hemmung der bakteriellen Hyaluronidase SagHyal4755. Außerdem waren alle Verbindungen inaktiv am bovinen Enzym (BTH).
Ein Teilprojekt beschäftigte sich mit der Charakterisierung von Hyaluronidasen aus Schlangengiften zweier verschiedener Spezies, Bitis arietans (Puffotter) und Naja siamensis (Indochinesische Speikobra). Beide Gifte enthalten Hyaluronidasen mit Molmassen zwischen 45 kDa und 65 kDa und maximaler enzymatischer Aktivität bei saurem pH-Wert (pH 4-7). Vier verschiedene Verbindungen wurden auf Inhibition dieser beiden Schlangengift-Hyaluronidasen untersucht. Dabei zeigten diese Substanzen nur schwache oder keine Hemmung, möglicherweise aufgrund ihrer ausgeprägten Bindung an Proteine, die in hohem Anteil in dem in gefriergetrockneter Form eingesetzten Schlangengift enthalten waren.
Insgesamt wurden unter den synthetisierten Verbindungen mit drei unterschiedlichen chemischen Grundgerüsten Hemmstoffe der bakteriellen Hyaluronidase SagHyal4755 mit IC50-Werten im zweistellig mikromolaren Bereich identifiziert.
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