| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (3MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-299842
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.29984
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 21 Mai 2014 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Armin Kurtz |
| Tag der Prüfung: | 28 April 2014 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Physiologie > Prof. Dr. Armin Kurtz |
| Stichwörter / Keywords: | Reninzellrekrutierung, Stickstoffmonoxid, endotheliale NO-Synthase |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 29984 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Eine Zu- oder Abnahme der Anzahl reninbildender Zellen in der Niere ist verschiedenen Einflüssen unterworfen und basiert auf einem metaplastischen Transformationsvorgang. Dieser als Rekrutierung bezeichnete Mechanismus ist auf eine Umwandlung von Renin-Vorläufer- zu reninbildenden Zellen zurückzuführen, wobei sowohl glatte Muskelzellen als auch extraglomeruläre Mesangiumszellen als ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Eine Zu- oder Abnahme der Anzahl reninbildender Zellen in der Niere ist verschiedenen Einflüssen unterworfen und basiert auf einem metaplastischen Transformationsvorgang. Dieser als Rekrutierung bezeichnete Mechanismus ist auf eine Umwandlung von Renin-Vorläufer- zu reninbildenden Zellen zurückzuführen, wobei sowohl glatte Muskelzellen als auch extraglomeruläre Mesangiumszellen als Vorläuferzellen fungieren können. Bei Stimulation des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems, beispielsweise durch Salzrestriktion oder Hypotension, kommt es zu einer Steigerung dieser Rekrutierungsvorgänge in retrograder Richtung vom vaskulären Pol der Glomeruli zu den großen renalen Gefäßen (Barajas, 1979; Taugner et al., 1984). Welchen Regulationsfaktoren dieser Vorgang unterworfen ist, ist bisweilen noch weitgehend unbekannt, jedoch scheint es wahrscheinlich, dass NO als wichtigster Mediator der Reninsekretion, auch hinsichtlich des Rekrutierungsmechanismus eine bedeutende Rolle spielt.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Relevanz von endothelial gebildetem Stickstoff-monoxid für die Rekrutierung reninbildender Zellen herausgearbeitet werden. Darüber hinaus stellte sich die Frage, inwiefern dieser Einfluss ein indirekter, vom Blutdruck abhängiger, ist oder es es sich vielmehr um eine direkte Wirkung des NO auf die reninbildenden Zellen, beispielsweise via cGMP-vermittelter Signaltransduktionsmechanismen, handelt.
Zu diesem Zweck wurden Versuchstiere unterschiedlichen Genotyps hinsichtlich ihres Rekrutierungsverhaltens untersucht. Eine Kombinationsbehandlung aus salzarmer Diät und ACE-Hemmung mittels Enalapril (LS/E) wurde allen Tieren verabreicht, um eine Stimulation des RAAS zu erreichen. Die Wirkung der Salzrestriktion auf die Reninkonzentration beruht dabei auf Macula Densa-getriggerten Regulationsfaktoren, welche mit Hilfe von Salzsensoren den NaCl-Gehalt im tubulären System der Niere registrieren und in Abhängigkeit davon durch verschiedene Mediatoren Einfluss auf die Reninfreisetzung nehmen. Die ACE-Inhibition mittels Enalapril beruht auf einer Blockade der Umwandlung von ANG I zu ANG II und damit einer Hemmung der ANG II-vermittelten Vasokonstriktion und Inhibition der Reninfreisetzung der JG-Zellen als Teil der negativen Rückkopplungsschleife des RAAS. Ein Fehlen dieses hemmenden Effekts begünstigt demnach die Reninsekretion.
Mit Hilfe fluoreszenzgefärbter histologischer Bilder konnte das Rekrutierungsmuster der verschiedenen Genotypen verfolgt und untersucht werden. Die computer-gesteuerte dreidimensionale Aufarbeitung ausgewählter Gefäßbaumabschnitte ist der zweidimensionalen Darstellung in vielerlei Hinsicht überlegen und erlaubt die genaue Verfolgung des Rekrutierungshergangs sowie die Untersuchung der Verteilung reninbildender Zellen im dreidimensionalen Raum. Zusätzlich zu dieser semiquantitativen Darstellung der reninbildenden Zellen erfolgte eine Renin-mRNA-Analyse zur quantitativen Bestimmung des Reningehaltes sowie auch die Messung des Blutdrucks der einzelnen Versuchstiere.
Neben wildtypischen Mäusen, wurden mittels dieser Methoden zudem eNOS-Knockout-, AT1a-Knockout-, sowie Cx40-defiziente Tiere im Hinblick auf ihr Rekrutierungsverhalten und ihre Blutdruckparameter untersucht.
Wildtypische Mäuse ließen dabei in Folge der LS/E-Behandlung ein deutliches retrogrades Rekrutierungsmuster entlang der afferenten Arteriole erkennen, welches auf die Transformation glatter Gefäßmuskelzellen zu reninbildenden Zellen zurückzuführen ist. Auch die mRNA-Werte zeigten eine signifikante Zunahme der Reninkonzentration um den Faktor 14 nach Stimulation des RAAS.
Derartiges konnte bei eNOS-defizienten Tieren, bei denen aufgrund eines genetischen Knockouts die Bildung von endothelialem NO blockiert ist, nicht beobachtet werden. Aus den 3D-Rekonstruktionen sowie den mRNA-Analysen geht deutlich hervor, dass die eNOS-Knockouttiere auf die LS/E-Gabe zwar mit einer Zunahme der Reninkonzentration reagieren – die Renin-mRNA-Analyse erbrachte eine Zunahme der Reninkonzentration um den Faktor 7im Verlgeich zu unbehandelten eNOS-Knockouttieren – dies ist jedoch, wie aus den 3D-Modellen deutlich hervorgeht, auf eine präglomeruläre Clusterbildung und nicht auf eine retrograde Reninzellrekrutierung zurückzuführen. Das Fehlen von endothelial gebildetem NO ist demnach mit einem fehlenden Rekrutierungsmechanismus vergesellschaftet, was die Bedeutung von NO für diesen Vorgang unterstreicht.
Die AT1a-Knockouttiere lieferten bereits ohne vorherige Stimulation signifikant höhere Renin-mRNA-Werte als die wildtypischen Referenztiere. Da aufgrund des genetischen Knockouts die ANG II-Wirkung an AT1a-Rezeptoren bei diesem Tiermodell fehlt, wurde auf die Zugabe eines ACE-Inhibitors verzichtet. Renin-zellrekrutierung zeigt sich hier bereits ohne LS-Behandlung. Eine Niedrigsalz-Diät führt bei den AT1a-Knockouttieren zu einer enormen Rekrutierungssteigerung, welche sich bis in die Interlobulararterien verfolgen lässt. Im Vergleich zum unbehandelten AT1a-Knockout zeigte sich in der Renin-mRNA-Analyse eine 5fache Steigerung des Reningehaltes durch LS-Diät.
Auch die Cx40-defizienten Tiere reagierten auf die Gabe von LS/E mit einer deutlichen Steigerung der Reninkonzentration um das 18fache im Vergleich zu unbehandelten Cx40-Knockoutmäusen sowie auch eine Zunahme des Rekturierungsverhaltens. Dieses findet jedoch nicht in retrograder Richtung entlang der arteriellen Gefäße statt, sondern ektopisch im extraglomerulären Mesangium, was die Bedeutung von Cx40 als Bestandteil der Gap Junctions zwischen den reninbildenden Zellen unterstreicht.
Um die Relevanz von NO für die Reninzellrekrutierung zu untersuchen, wurde einem Teil der Versuchstiere zusätzlich zur LS/E-Behandlung der NOS-Inhibitor L-NAME verabreicht, welcher unspezifisch alle NOS-Isoformen inhibiert und somit pharmakologisch die NO-Wirkung systemisch blockiert. Derartig behandelte Mäuse zeigten eine signifikant geringere bzw. eine fehlende Zunahme ihres Reningehaltes durch LS/E-Gabe als die Tiere gleichen Genotyps ohne NO-Blockade. So konnte bei wildtypischen Tieren eine 14fache Steigerung des Reningehaltes durch LS/E-Behandlung erreicht werden, die zusätzliche Gabe von L-NAME hingegen erbrachte eine nur 5fache Zunahme des Renin-mRNA-Gehaltes. Eine ähnliche Beobachtung ließ sich bei den AT1a-Knockouttieren machen. Hier führte die Niedrigsalzdiät zu einer 5fachen Steigerung des Renin-mRNA-Gehaltes im Vergleich zu unbehandelten AT1a-Knockoutmäusen, wohingegen die simultane L-NAME-Substitution mit keiner wesentlichen Steigerung der Reninkonzentration vergesellschaftet war. Der Cx40-Knockout erbrachte vergleichbare Resultate. Hier führte die LS/E-Substitution zu einer 18fachen Zunahme des Renin-mRNA-Gehaltes im Vergleich zum unbehandelten Cx40-Knockout, wohingegen die zusätzliche L-NAME-Gabe keine nachweisbare Steigerung der Renin-mRNA-Konzentration erbrachte. Dieses Phänomen war beim eNOS-defizienten Mausmodell jedoch nicht zu beobachten. Dieses lieferte in der 3D-Rekonstruktion keinerlei Veränderung hinsichtlich seines Reninexpressionsmusters nach L-NAME-Gabe im Vergleich zu den Referenztieren. Eine L-NAME-Wirkung konnte demnach im eNOS-Knockout nicht beobachtet werden. Die Analyse des Renin-mRNA-Gehaltes bestätigte dieses Ergebnis. Während die LS/E-Behandlung der eNOS-Knockouttiere zu einer 7fachen Zunahme des Reningehaltes führte, zeigte sich durch gleichzeitige L-NAME-Subsitution keine signifikant verringerte Reninkonzentration. Im Gegenteil führte diese Maßnahme sogar zu einer – wenn auch nicht signifikanten – Zunahme des Renin-mRNA-Gehaltes. Das Fehlen der Reninzellrekrutierung sowie der fehlende Einfluss der systemischen NO-Blockade im eNOS-Knockoutmodell liefert somit einen wichtigen Hinweis darauf, dass die Transformation von Renin-Vorläufer- zu reninbildenden Zellen ein von endothelial gebildetem NO abhängiger Mechanismus ist, während iNOS und nNOS eine eher untergeordnete Rolle zu spielen scheinen.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war darüber hinaus, die Ergebnisse der mRNA-Analyse sowie der Rekonstruktionsverfahren mit den Blutdruckparametern der Versuchstiere zu vergleichen. Dabei konnte eine deutlich inverse Relation zwischen Renin-mRNA-Gehalt und systolischem Blutdruck gezeigt werden. Hohe mRNA-Level sind demnach mit einem geringen, niedrige mRNA-Level mit einem hohen systolischen Blutdruck vergesellschaftet. Diese Resultate weisen auf einen – zumindest teilweise – indirekten, vom Blutdruck abhängigen, Einfluss von NO auf die Reninzellrekrutierung hin. NO bewirkt als starker Vasodilatator eine Weitstellung der Gefäße und auf diese Weise eine Blutdrucksenkung. Dies wiederum führt aufgrund einer verminderten renalen Perfusion zur Stimulation der Reninsynthese infolge einer vermehrten Reninzellrekrutierung. Im Umkehrschluss führt – wie in dieser Arbeit dargestellt - die systemische Blockade von NO mittels L-NAME zu einer Zunahme des systolischen Blutdrucks und infolge dessen zu einer verminderten Reninzellrekrutierung. Endothelial gebildetes NO triggert somit durch eine Senkung des systemischen Blutdrucks die Transformation von Renin-Vorläufer- zu reninsynthetisierenden Zellen. Auf welche Art und Weise die Modulation des Blutdrucks derartige Transformationsvorgänge zu bewirken vermag, ist ist jedoch noch weitestgehend unklar. Ob eine zusätzliche direkte cGMP-abhängige Wirkung von NO auf die reninbildenden Zellen des juxtaglomerulären Apparates besteht, ist durch die Ergebnisse dieser Arbeit nicht auszuschließen und wird Gegenstand künftiger Untersuchungen sein.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
An increase and decrease of the number of renin-producing cells in the kidney depends on different influences and is based on a metaplastic transformation of renin-precursor cells into renin-producing cells. Preglomerular vascular smooth muscle cells as well as extraglomerular mesangium cells can be renin-precursor cells. A stimulation of the renin-angiotensin-aldosteron-systems, for example ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
An increase and decrease of the number of renin-producing cells in the kidney depends on different influences and is based on a metaplastic transformation of renin-precursor cells into renin-producing cells. Preglomerular vascular smooth muscle cells as well as extraglomerular mesangium cells can be renin-precursor cells. A stimulation of the renin-angiotensin-aldosteron-systems, for example through salt restriction or hypotension, leads to an increase of renin-cell-recruitment from the vascular pole of every glomerulum backwards along the afferent arteriole. The cellular mechanisms triggering the recruitment of renin-producing cells are not well understood, but it is a common observation that nitric oxide is an important mediator of renin production, therefore, it seems probable that there is also an influence of nitric oxide on the mechanism of renin-cell-recruitment.
Therefore, the aim of this study is to show the importance of - especially endothelially derived - nitric oxide for renin-cell-recruitment. Another question that was dealt with was whether this influence is an indirect one caused by influence on systemic blood pressure or a more direct one by – for example - cGMP-dependant signaltransducing mechanisms.
For this purpose, the renin-cell-recruiting mechanisms have been analyzed in different experimental groups. In order to stimulate the RAAS, all mice have been fed a combination of low-salt diet together with the angiotensin I-converting enzyme inhibitor enalapril for 3 weeks. Both factors lead to a striking increase of renin-expression via different mechanisms. Salt restriction causes a stimulation of renin production via influence on macula densa-dependent mediating factors, whereas enalapril inhibits the production of angiotensin II and therefore, the ang II-triggered vasoconstriction as well as the blockade of renin-synthesis as part of the negative feedback.
By using immunhistochemistry for renin and α-smooth muscle actin in the kidney, the pattern of renin-cell-recruitment can be observed. By using the computer program AMIRA serial slices, immunfluorescently stained against α-smooth muscle actin and renin were digitized in order to reconstruct parts of the renal arterial tree with its corresponding renin distribution.
Besides total renin-mRNA was isolated from frozen kidneys and quantified by a photometer. One microgram of the resulting RNA was used for RT-PCR. For quantification of renin mRNA expression, real time RT-PCR was performed using an LC 480 Light Cycler Instrument. Apart from that, blood pressure of all mice has been measured. We used wild-type mice as well as eNOS-Knockout, AT1a-Knockout and Cx40-Knockout mice.
Wild-type mice showed a 14fold increase of renin-mRNA-concentration by treatment with LS/E. The 3D-reconstruction shows that this increase is based on a reversible phenotype switch from smooth muscle cells into renin-producing cells in the media layer in the afferent arteriole. This renin-cell-recruitment cannot be seen in eNOS-knockout mice. Indeed, there is a 7fold increase of renin-mRNA-concentration by treatment with LS/E compared to untreated eNOS-knockout mice, but this increase – as can obviously be seen in the 3D-reconstructed arterial tree – is not caused by renin-cell-recruitment along the afferent arteriole, but by cuff-like appositional layers of renin-expressing cells at the glomerular vascular pole, which creates the impression of juxtaglomerular hypertrophy. Considering this aspect, the conclusion can be drawn that the lack of endothelial derived NO is associated with the lack of renin-cell-recruitment. This points out the significance of endothelially derived NO for the mechanism of renin-cell-recruitment.
Even without stimulating treatment, AT1a-Knockout mice show higher renin-concentration than untreated wild-type mice. As in this knockout, the effect of ang II on the AT1a-receptor is lacking one abstained from the additional substitution of enalapril. Low salt diet leads to a 5fold increase of renin-mRNA-levels compared to the untreated AT1a-Knockout. The 3D-reconstruction shows that renin-expressing cells are already found along the whole length of afferent arterioles in untreated AT1a-Knockout mice. By stimulation via low salt intake also in the Aa. Interlobulares as an consequence of renin-cell-recruitment.
Cx40-knockout mice also showed a significant increase of renin-cell-recruitment by treatment with LS/E. An 18fold increase of renin-mRNA-levels can be observed compared to the untreated Cx40-/-. Regarding the 3D-reconstructed renal arterial tree, it gets obvious that renin-cell-recruitment does not happen along the afferent arteriole, but ectopically in the extraglomerular mesangium, which points out the importance of connexin 40 for gap junctional connection between renin-expressing cells.
This study is aimed at showing the significance of nitric oxide for renin cell recruitment. Therefore, one half of the animals have been treated with the unspecific NOS-inhibitor L-NAME additionally to LS/E. Mice fed this way showed a significantly lower or even a lacking increase of the number of renin-expressing cells induced by treatment with LS/E. Thus, wild-type mice showed a 14fold increase of renin-mRNA-levels by treatment with LS/E, whereas there was only a 5fold increase by additional L-NAME-substitution. The 3D-reconstruction shows that this is due to a lacking renin-cell-recruitment by blockade of systemic nitric oxide, whereas the juxtaglomerular hypertrophy is not influenced.
Similar results can be observed in AT1a-Knockout mice. Treatment with LS leads to a 5fold increase of renin-mRNA-levels compared to untreated AT1a-Knockout mice, whereas the additional treatment with L-NAME does not cause any increase of renin-concentration.
Cx40-knockout mice showed an 18fold increase of renin-mRNA-levels by having been fed with LS/E compared to untreated Cx40-knockouts. The additional substitution of the NOS-inhibitor L-NAME did not lead to a significant increase of renin-concentration.
This notable influence of systemic blockade of nitric oxide on the renin-cell recruitment could not be observed in eNOS-/- mice. Treatment with LS/E led to a 7fold increase of renin-mRNA-levels in comparison to untreated eNOS-/- mice. The additional L-NAME substitution did not lower the number of renin-expressing cells. On the contrary, it even led to a non-significant increase of renin-mRNA-levels.
The lack of renin cell recruitment as well as the absent influence of systemic blockade of nitric oxide by L-NAME in the eNOS-knockout points out that renin-cell-recruitment is a mechanism predominantly dependent on endothelially derived nitric oxide, whereas other NOS-isoform – nNOS and iNOS – seem to play a negligible role.
Nevertheless, the question remains if the influence of endothelially derived NO is a direct one - caused for example by cGMP dependant signal transduction-, or if it is an indirect influence -caused by blood pressure change triggered by NO. Therefore systolic blood pressure has been measured and compared to the results of the renin-mRNA-levels. An inverse relation beteween renin-mRNA-levels and blood pressure could be proved. High levels of renin-mRNA are linked with low blood pressure and vice-versa. These results point out an at least partially indirect influence of NO on renin-cell-recruitment by a change in blood pressure. As a strong vasodilatator, NO causes a widening of blood vessels and therefore, a decrease in blood pressure. Because of reduced renal perfusion this leads to a stimulation of renin synthesis as a result of an increased renin-cell-recruitment. Argumentum e contrario, the systemic blockade of NO via L-NAME leads to an increase in blood pressure and therefore, to a reduced renin-cell-recruitment. Based on the findings of this study, it seems that endothelially derived NO triggers the transformation of renin-precursor- into renin-producing cells by reducing the systemic blood pressure. It is not clear how modulation of blood pressure could cause these recruiting mechanisms. Nevertheless, an additional direct cGMP dependent effect of NO on renin-producing cells of the juxtaglomerular apparatus cannot be excluded and will be dealt with in future studies.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 01:07
Nur für Besitzer und Autoren: Kontrollseite des Eintrags
Downloadstatistik