| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen mit Print on Demand (7MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-299923
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.29992
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 20 Mai 2015 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Tag der Prüfung: | 9 Mai 2014 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Stichwörter / Keywords: | CanA, Pyrodictium abyssi, Cannulae |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 29992 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem aus Pyrodictium abyssi isolierten Protein CanA, welches in der Lage ist, ein hitzebeständiges, nicht denaturierbares, organisches Hohlfasernetzwerk zu bilden. Die industriellen Einsatzmöglichkeiten wie z.B. als sich selbst polymerisierende Membranen, stereospezifisch durchlässige Hohlfaserkanäle, Stoff fixierende Nanoröhren oder sogar als organische Leiter ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem aus Pyrodictium abyssi isolierten Protein CanA, welches in der Lage ist, ein hitzebeständiges, nicht denaturierbares, organisches Hohlfasernetzwerk zu bilden. Die industriellen Einsatzmöglichkeiten wie z.B. als sich selbst polymerisierende Membranen, stereospezifisch durchlässige Hohlfaserkanäle, Stoff fixierende Nanoröhren oder sogar als organische Leiter sind nahezu grenzenlos. Für den spezifischen Einsatz eines solchen Proteins sind jedoch Modifikationen, sowie genaue Kenntnisse über das Polymerisationsverhalten, die Proteinstruktur und die Interaktionsstellen des Proteins von Nöten.
Das Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe unterschiedlicher analytischer und spektroskopischer Methoden detaillierte strukturelle und biochemische Informationen über das Protein CanA und sein Polymerisationsverhalten zu erhalten.
Das Protein CanA unterliegt nicht nur einer induzierten Polymerisation, sondern auch einer voranschreitenden Eigenpolymerisation. Daher war es für die Strukturaufklärung von größter Wichtigkeit, ein Konstrukt dieses Proteins zu entwickeln, welches bis auf die Polymerisierungsfähigkeit sämtliche strukturellen und physikalischen Eigenschaften von CanA beibehielt. Dieser Durchbruch gelang mit einem nur um 10 Aminosäuren verkürzten Protein Konstrukt namens K1-CanA. Desweiteren konnte die in-vitro Expression von unmarkiertem CanA bzw. K1-CanA in Hinsicht auf die Ausbeute und den Reinheitsgrad des isolierten Proteins durch einen veränderten Zellaufschluss und optimierte Reinigungsschritte enorm gesteigert werden. Zur Erreichung der gesetzten Ziele musste bewiesen werden, dass sowohl K1-CanA, CanA, wie auch dessen Polymere eine nahezu identische Struktur besitzen. Die strukturelle Gleichheit des Polymers mit dem Monomer CanA wurde mittels Fourier-Transformations-Infrarotmessungen bewiesen. Durch Circulardichroismus-Spektroskopie-Experimente konnte gezeigt werden, dass CanA und K1-CanA eine identische Sekundärstruktur (5% α-Helix, 41% β-Faltblatt, 53% coil) besitzen. Ein Vergleich der 15N Signale durch 2D NMR Messungen zeigte eine nahezu identische chemische Umgebung aller vorkommenden Aminosäuren der Proteine CanA und K1 CanA. Diesbezüglich konnte sowohl für K1-CanA, CanA und dessen Polymer eine einheitliche Sekundärstruktur bewiesen werden. Mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung konnte die Partikelgröße von monomeren CanA mit 3.38 nm bzw. 3.48 nm bestimmt werden. Diese Partikelgrößenverhältnisse bestätigten auch die durchgeführten NMR-Diffusionsmessungen, bei denen CanA als Monomer im nativen Zustand mit einem hydrodynamische Radius Rh von 1.68 nm klassifiziert wurde. Die Eigenpolymerisation, sowie die Polymerisierungseigenschaften von CanA zu Cannulae bzw. die nicht vorhandenen Polymerisationsfähigkeiten von K1-CanA, wurden durch Transmissions-Elektronenmikroskopie Messungen dokumentiert. Die synthetisierten Cannulae entsprachen in ihrer Form und den Dimensionen (Durchmesser ca. 30 nm) in etwa den natürlichen Cannulae im Netzwerk von Pyrodictium abyssi. Trotz der für die NMR kritischen Größe von 18.7 kDa des Proteins K1-CanA, wurden nahezu sämtliche chemischen Verschiebungen über verschiedenste 2D und 3D NMR Messungen identifiziert. Hierdurch konnten definitive Aussagen über die Sekundärstruktur des Proteins getroffen werden. Die über TALOS+ bestimmte Abfolge der Sekundärstrukturelemente von K1 CanA lautet βββαββββαββββββ (6% α Helix, 44% β-Faltblatt und 50% coil). Der größte Teil der β-Faltblätter von K1-CanA ist in 2 großen, miteinander verbundenen Faltblattebenen zu 3 bzw. 5 antiparallelen β Faltblattsträngen koordiniert. Diese Faltblattebenen stehen sich gegenüber und bilden ein β-Faltblatt-Barrel. Anhand von (1H-15N-) sofast-HMQC-Spektroskopie-Messungen konnten die zur induzierten Polymerisation benötigten Ca2+ / Mg2+ Bindungsstellen identifiziert und die Bindungskonstanten bestimmt werden. Die Bindungsstellen befinden sich jeweils an den flexiblen Enden des β-Faltblatt-Barrels. Sowohl bei K1-CanA als auch bei CanA ist die Bindungsstelle 1 mit KD (K1-CanA) = 0.774 +/- 0.046 mM bzw. KD (CanA) = 1.00 +/ 0.06 mM im Vergleich zur Bindungsstelle 2 mit KD (K1-CanA) = 10.7 +/ 2.2 mM bzw. KD (CanA) = 15.1 +/ 1.8 mM deutlich Calcium affiner. Im Bezug auf Magnesium besitzen beide Bindungszentren die gleiche Affinität - Bindungsstelle 1: KD (K1-CanA) = 3.19 +/- 0.35 mM bzw. KD (CanA) = 3.90 +/- 0.11 mM; Bindungsstelle 2: KD (K1-CanA) = 3.18 +/ 0.62 mM und KD (CanA) = 3.85 +/ 0.24 mM. Die gewonnenen NMR Daten wurden anschließend in einer Strukturrechnung über CNS verwendet und ermöglichten eine erste Strukturrechnung des Proteins K1-CanA. Anhand dieser Struktur konnte gezeigt werden, dass jede CanA Untereinheit in einem Cannulae an 5 seiner 6 seitigen Oberfläche Kontaktpunkte zu weiteren CanA Untereinheiten aufweist. Der flexible, zur Polymerisation benötigte N Terminus von CanA ist hierbei auf der Seite ohne weitere Kontaktflächen lokalisiert. Die Sekundärstrukturinformation aller in dieser Arbeit verwendeten Messmethoden stimmten mit der durchgeführten Berechnung der Struktur überein.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
This dissertation is about the protein CanA isolated from a species of Pyrodictium abyssi. The Protein CanA is able to generate a heat stable, non denaturable organic tube-network. The industrial use of these networks could be self polymerizing membranes, stereo specific permeable channels, molecule binding nanotubes or also organic conductors. For the significant application of such networks you ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
This dissertation is about the protein CanA isolated from a species of Pyrodictium abyssi. The Protein CanA is able to generate a heat stable, non denaturable organic tube-network. The industrial use of these networks could be self polymerizing membranes, stereo specific permeable channels, molecule binding nanotubes or also organic conductors. For the significant application of such networks you need specific modifications, the knowledge of the polymerization behavior, the protein structure and the knowledge of the interaction sides.
The target of this work was to get detailed structural and biochemical information about the Protein CanA and its polymerization behavior by using different analytical and spectroscopic methods.
The protein CanA has the ability for self polymerization or induced polymerization. For the structural analysis it was very important to have a construct of this protein, which has the same structural and physical abilities as CanA without the polymerization effect. This was achieved by a protein construct called K1-CanA which has just 10 amino acids less than the native protein CanA. The in-vitro Expression of the non marked protein CanA and its construct K1-CanA was highly improved by ist purity and its yield. To reach the goals it was necessary to proof that K1-CanA, CanA and its polymer have an identical structure. The structural equivalent of the monomer and the polymer of CanA were proven by Die Fourier-Transformed-Infrared-measurements. The identical equivalent of the secondary structure of K1-CanA and CanA was proven by CircularDichroism-Spectroscopy-experiments (5% α-helical, 41% β-sheet, 53% coil). A comparison of the 15N signals by 2D NMR measurements indicated an identical chemical environment of CanA and K1-CanA. In this regard K1-CanA, CanA and its polymer have a uniform secondary structure. The particle size of monomer CanA is about 3.38 nm to 3.48 nm and was determined by Dynamic-Light-Scattering. The particle size confirms the NMR-Diffusion-experiments where the hydrodynamic ratio Rh of CanA reached 1.68 nm. The self polymerization and the induced polymerization for CanA to Cannulae respectively the non polymerization ability of K1-CanA were documented by Transmission-Electron-Microscopy. The synthesized Cannulae had the same shape and dimension like the native Cannulae. In the network of Pyrodictium abyssi. In spite oft he critical size of 18.7 kDa of the protein K1-CanA nearly all chemical shifts were identified by 2D and 3D NMR measurements. Due to those information a definite declaration of the secondary structure was confirmed. The secondary structure of K1-CanA with βββαββββαββββββ (6% α Helix, 44% β-Faltblatt und 50% coil) was determined with TALOS+. Most of the β-sheets of K1-CanA are coordinated in 2 big sheet planes (3 and 5 antiparallel β-sheets) which are bonded together. These β-sheet planes form a structure which looks like a β-barrel. The binding sides of the Ca2+ / Mg2+ induced polymerization were identified by (1H-15N-) sofast-HMQC-spektroscopy measurements. The binding sides are located in the flexible endings of the β-barrel look alike structure. The binding position 1 of K1-CanA (KD (K1-CanA) = 0.774 +/- 0.046A mM) and CanA (KD (Can) = 1.00 +/ 0.06 mM) is in comparison to binding position 2 with KD (K1-CanA) = 10.7 +/ 2.2 mM and KD (CanA) = 15.1 +/ 1.8 mM much more calcium affine. Related to magnesium the binding sides have the same affinity: binding position 1: KD (K1-CanA) = 3.19 +/- 0.35 mM and KD (CanA) = 3.90 +/- 0.11 mM; binding position 2: KD (K1-CanA) = 3.18 +/ 0.62 mM and KD (CanA) = 3.85 +/ 0.24 mM. With the gathered NMR Data of K1 CanA first structure calculations were realized by CNS. Based to the calculated protein surface it was possible to make a declaration of the interaction sides between the CanA subunits in the polymer. Each subunit has contact areas to other subunits on 5 of 6 sides. The flexible N-Terminus which is necessary fort he polymerization is located on the side which has no contact to other subunits. The secondary structure information of all used methods in this work are confirm with the information of the calculated structure.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 01:06
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