Die Effekte der Carboanhydrase IX-Inhibition auf die Chemo- und Strahlensensibilität von Glioblastomzellen

URN zum Zitieren dieses Dokuments:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-307089
DOI zum Zitieren dieses Dokuments:: 10.5283/epub.30708

Baumgartner, Jana Paulina Teresa

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Veröffentlichungsdatum dieses Volltextes: 01 Sep 2014 13:38

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Dokumentenart:	Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation)
Open Access Art:	Primärpublikation
Datum:	1 September 2014
Begutachter (Erstgutachter):	PD Dr. Martin Proescholdt
Tag der Prüfung:	28 August 2014
Institutionen:	Medizin > Lehrstuhl für Neurochirurgie
Stichwörter / Keywords:	glioblastoma multiforme, hypoxia, CAIX, pH
Dewey-Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin
Status:	Veröffentlicht
Begutachtet:	Ja, diese Version wurde begutachtet
An der Universität Regensburg entstanden:	Ja
Dokumenten-ID:	30708

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Zusammenfassung (Deutsch)

Zusammenfassung (Deutsch)

Fragestellung: Das Glioblastom, der häufigste hirneigene maligne Tumor im Erwachsenenalter, weist trotz multimodaler Therapie eine schlechte Prognose auf. Ein gesteigerter glykolytischer Metabolismus, intratumorale Hypoxie sowie eine resultierende erhöhte Expression der Carboanhydrase IX sind charakteristische Merkmale des Glioblastoms. Die CAIX ist in die Regulation des tumoralen pHs entscheidend involviert und für die Säurepufferung der Tumorzellen überwiegend verantwortlich. Dieses membranständige Enzym stellt den Export der im glykolytischen Metabolismus anfallenden Säuren sicher und trägt außerdem durch die Produktion von Bikarbonat zur Pufferung des Zytoplasmas bei. Deshalb nehmen wir an, dass die Induktion der CAIX mit der Entwicklung eines aggressiveren Phänotyps einhergeht.
Diese Eigenschaften machen die CAIX zu einem attraktiven Angriffspunkt einer zielgerichteten Tumortherapie. Die vorliegende Studie hat zum Ziel, die Wirkung der CAIX-Inhibition auf das Ansprechen von Glioblastomzellen auf Temozolomid-Chemotherapie und Bestrahlung zu untersuchen.

Material und Methodik: Für die Versuche wurden Glioblastomzellen der Zelllinie U251 verwendet. Der genetische Knockout der CAIX erfolgte durch die Transfektion der Zellen mit spezifischer CAIX siRNA, die Kontrollgruppe wurde mit unspezifischer siRNA NSC transfiziert. Am nächsten Tag erfolgte die Zugabe der 5 mM- bzw. 125 mM Glucoselösungen und die anschließende Kultivierung der Zellen für 24 h in einer Hypoxiekammer (Luftzusammensetzung: 5% CO2 und 95% N2) bzw. unter Normoxie. Die Studie umfasste somit folgende Kombinationen: CAIX-Knockout/NSC-Kontrolle, Hypoxie/Normoxie, niedrige/hohe Glucosekonzentration. Nach Ablauf der 24 h wurden die Zellen den verschiedenen Behandlungen zugeführt. Es erfolgte die Zugabe von 50 µmol des alkylierenden Chemotherapeutikums Temozolomid bzw. die einmalige Bestrahlung der Zellen mit 10 Gy. Anschließend wurden die Hypoxieplatten für weitere 24 h unter Hypoxie kultiviert. Der Zustand der Zellen musste 24 h, 48 h, 120 h sowie 144 h nach Bestrahlung bzw. Chemotherapie kontrolliert und mittels mikroskopischer Aufnahmen dokumentiert werden.
Am 6. Tag nach Bestrahlung bzw. Temozolomid-Gabe wurde ein Proliferationsassay (96® AQueous One Solution) durchgeführt, um die noch zur Zellteilung fähigen Zellen zu quantifizieren. In einem weiteren Ansatz mussten die Zellen auf Deckgläsern kultiviert werden, sodass am 6. Tag nach Bestrahlung bzw. Temozolomid-Gabe frühapoptotische Zellen mittels Annexin-Färbung und anschließender fluoreszenzmikroskopischer Untersuchung bestimmt werden konnten.

Ergebnisse: Die CAIX-Expression in U251-Zellen wurde unter Hypoxie dramatisch hochreguliert. Eine erfolgreiche Hemmung der CAIX-Expression in hypoxischen Glioblastomzellen durch RNA-Interferenz konnte mittels molekularbiologischen Untersuchungen verifiziert werden.
Schließlich führte die Inaktivierung der Carboanhydrase IX nach Bestrahlung sowie nach TMZ-Chemotherapie zu einer reduzierten Proliferationsrate sowie zu einer erhöhten Apoptoserate der Tumorzellen, sodass die CAIX-Inhibition das Ansprechen von Glioblastomzellen auf diese Therapien in vitro verbessert, wobei der Effekt unter TMZ-Chemotherapie stärker ausgeprägt war als unter Bestrahlung. Außerdem waren Hypoxie und glykolytische Bedingungen erforderlich, um eine optimale Wirkung der CAIX-Inhibition zu erzielen, wodurch ein Zusammenhang zwischen CAIX-Expression und therapeutischem Effekt nachgewiesen werden konnte.

Schlussfolgerung: Die spezifische Inhibition der Carboanhydrase IX sensibilisiert Glioblastomzellen für Bestrahlung und Temozolomid-Chemotherapie unter hypoxischen und glykolytischen Bedingungen und könnte eine attraktive Strategie darstellen, um als eine metabolisch orientierte Therapie die Behandlung maligner Gliome zu verbessern.

Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)

Purpose:
Glioblastoma multiforme is the most frequent primary brain tumor in adults. In spite of multimodal treatment, overall survival is still poor. Malignant gliomas are metabolically characterized by enhanced glycolysis, high degree of intratumoral hypoxia resulting in high CAIX expression levels compared to the normal brain. Despite increased glycolytic metabolism leading to significant acid load, the intracellular pH of brain tumors is more alkaline than normal brain. Due to their topology, CA IX has been shown to regulate the extracellular concentration of H+, CO2 and HCO3-, thereby moderating intra- and extracellular pH and leading to an acidic extracellular environment which may facilitate invasion of malignant cells into the brain parenchyma. We hypothesized that CAIX induction in brain tumor contributes to an aggressive phenotype.
The goal of our study was to investigate the influence of CAIX expression on the efficacy of chemotherapy and radiation.

Materials and Methods:
In vitro, U251 glioblastoma cells were incubated for 24 h in a sealed, humidified 5% CO2 module with either 21% oxygen and 25 mM glucose in the culture medium (normoxia) or 0% oxygen (hypoxia) plus 125 mM glucose to induce CAIX expression and to further enhance the glycolytic metabolism. CAIX knockdown was performed by RNA interference (siRNA) to examine the function of CAIX on the susceptibility to adjuvant treatment. Hypoxic induction of CAIX mRNA expression and the effects of RNA interference were verified by quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), western blotting and immunofluorescence staining.
Influence of CAIX expression on the efficacy of chemotherapy was investigated by temozolomide treatment at a concentration of 50 mM over 6 days. Radiation effects were studied by irradiating U251 cells with 10 Gy with use of a 6-MV linear accelerator. Cell toxicity was microscopically observed and measured by using a colorimetric proliferation assay (96® AQueous One Solution). Apoptotic cell death was studied by annexin V labeling.

Results:
Hypoxia resulted in a significant increase of CAIX expression. Transfection with a CAIX-specific siRNA construct reduced the CAIX expression levels.
CAIX interference significantly enhanced the susceptibility to adjuvant treatment which was evidenced by a reduction of cell viability and a higher rate of apoptotic cell death. The strongest effect of CAIX knockdown on cell toxicity was observed under hypoxia, glycolytic conditions and temozolomid treatment.

Conclusion:
CAIX knockdown in U251 glioblastoma cells enhanced the susceptibility to adjuvant treatment. Selective gene silencing of CAIX could display a new therapy strategy in the treatment of glioblastoma multiforme targeting the tumor metabolism.

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