| License: Publishing license for publications including print on demand (9MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-308601
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.30860
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 16 October 2014 |
| Referee: | PD Dr. Tim Maisch |
| Date of exam: | 9 October 2014 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Dermatologie und Venerologie |
| Keywords: | Photodynamische Inaktivierung von Bakterien, TMPyP, IPL, Blitzlampe, Hitzeschockprotein, DnaK, E. coli |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 30860 |
Abstract (German)
In der vorliegenden Doktorarbeit sollte in zwei Versuchskomplexen sowohl der Einfluss einer IPL-Blitzlichtlampe auf die photodynamische Inaktivierung von antibiotikaresistenten und -suszeptiblen Keimen als auch die Wirkung und Auswirkung des Hitzeschockproteins DnaK auf die photodynamische Suszeptibilität von E. coli in vitro untersucht werden. In Zeiten steigender Resistenzraten von Bakterien ...
Abstract (German)
In der vorliegenden Doktorarbeit sollte in zwei Versuchskomplexen sowohl der Einfluss einer IPL-Blitzlichtlampe auf die photodynamische Inaktivierung von antibiotikaresistenten und -suszeptiblen Keimen als auch die Wirkung und Auswirkung des Hitzeschockproteins DnaK auf die photodynamische Suszeptibilität von E. coli in vitro untersucht werden.
In Zeiten steigender Resistenzraten von Bakterien gegen Antibiotika bietet sich mit dem Wirkprinzip der Photodynamik ein vielversprechender Weg, auch in Zukunft Infektionen – nicht nur bakterieller Art – zu begegnen. Das Manko von photodynamischen Prozessen liegt bisher sowohl in den langen Inkubationszeiten von Farbstoff und Zielstruktur (Bakterien, Viren, Pilzen) als auch langen Expositionszeiten gegenüber der Belichtung. Diese sind notwendig, damit der PS bei den inkubierten Organismen eine photodynamische antimikrobielle Wirkung entfalten kann.
Bei Bakterien sind eine Reihe von unspezifischen Abwehrmechanismen bekannt, mit denen diese auf Stressfaktoren reagieren. Einer dieser Wege ist die Ausbildung von sogenannten heatshock- oder Hitzeschockproteinen (HSPs). Diese Klasse von Reparaturproteinen dient dazu, fehlgefaltete Proteine wiederherzustellen, was die schädliche Wirkung der ursächliche Stressoren zu reduzieren hilft. HSP-Expression unter photodynamischer Behandlung wurde bereits beschrieben, in dieser Doktorarbeit sollte darüber hinaus untersucht werden, in welchem Maß eine erhöhte Expression von HSP-Proteinen – am Beispiel von DnaK – zu einer verstärkten Widerstandsfähigkeit der Bakterien gegenüber der PIB beitragen könnte.
1.1 Blitzlichtverfahren mit IPL
Im ersten Teil der Arbeit wurde untersucht, inwiefern sich die bis dato in langen Belichtungszeiten übertragenen Lichtdosen in kurzer Zeit applizieren ließen und wie sich das auf den antimikrobiellen photodynamischen Effekt auswirke.
Dazu wurden verschiedene Bakterien mit TMPyP, einem in der Literatur gut bekannten und unter konventionellen Bedingungen (lange Belichtung) gut antimikrobiell wirksamen PS, inkubiert und anschließend durch eine handelsübliche Blitzlichtlampe IPL mit hochenergetischen Lichtblitzen von max. 100 ms Dauer belichtet. Die insgesamt applizierte Lichtdosis entsprach dabei mindestens derjenigen, die auch in konventionellen Versuchen mit 30 oder mehr Minuten Belichtungszeit erreicht wurde.
Nach einer sehr kurzen Inkubationszeit von 10 s und einer Konzentration des Photosensibilisators TMPyP von 10 µM zeigte eine Belichtung von lediglich 83 ms bei S. aureus, zwei unterschiedliche MRSA-Stämme sowie B. atrophaeus eine antibakterielle Effizienz von 99,999 %, was einer Reduktion um 5 log10-Stufen entspricht, unabhängig vom Antibiotikaresistenzmuster der verwendeten Isolate. Beim ebenfalls untersuchten Keim E. coli zeigte sich, dass stärkere Bedingungen notwendig waren, um den gleichen reduktiven Effekt zu erzielen. Hier wurden – bei derselben Inkubationszeit (10 s) – eine PS-Konzentration von 100 µM und drei Lichtblitze á 100 ms benötigt, um dieselbe Reduktionsrate zu erzielen.
1.2 Heatshock-Antwort
Der zweite Teil der vorliegenden Doktorarbeit hatte die bakteriellen Antwort- mechanismen auf photodynamische Behandlung zum Gegenstand. Die an anderer Stelle schon beobachtete reaktive HSP-Expression nach Stress unterschiedlicher Art sollte hinsichtlich ihres Vorhandenseins und Ausprägung nach Inkubation mit dem PS TMPyP und nachfolgender Bestrahlung untersucht werden.
Wurden Suspensionen von E. coli mit 0,5 µM TMPyP inkubiert und anschließend bestrahlt (subletale photodynamische Bedingungen), konnten mittels Western-Blot erhöhte Level des heatshock-Proteins DnaK nachgewiesen werden. Der Vergleich erfolgte mittels Bezugnahme auf die simultane Expression des housekeeping-Proteins GAPDH.
Es zeigte sich bei einer Konzentration von 1,0 µM TMPyP und Bestrahlung mit 12,06 J/cm², dass fast keine Proteine mehr nachweisbar waren, sowohl housekeeping- als auch heatshock-Protein waren in deutlich reduzierter Konzentration vorhanden. Als Grund hierfür ist höchstwahrscheinlich der starke oxidative Schaden durch generierten Singulett-Sauerstoff und ROS zu sehen.
Erhöhte Expression von HSP erzeugt eine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegenüber oxidativem Stress (ROS). In dieser Arbeit führte eine Temperaturerhöhung (50 °C) bei E. coli nicht zu einem abgeschwächten antimikrobiellen Effekt i. S. e. erhöhten Widerstandsfähigkeit gegen die nachfolgende PIB (Erzeugung von oxidativem Stress). Es konnte auch hier eine Reduktion um mehr als 5 log10-Stufen erreicht werden.
Gleichwohl ist anzumerken, dass durch die Temperaturerhöhung auf 50 °C keine vermehrte DnaK-Expression nachweisbar war.
Translation of the abstract (English)
The doctor thesis at hand analyses in two experimental parts the influence of an IPL flash lamp on the photodynamic inactivation of bacteria both resistant and susceptible to antibiotics as well as the effect of the heatshock protein DnaK on the in vitro susceptibility of E. coli to photodynamic treatment. In times of increasing rates of antibiotic resistances among bacteria the principle of ...
Translation of the abstract (English)
The doctor thesis at hand analyses in two experimental parts the influence of an IPL flash lamp on the photodynamic inactivation of bacteria both resistant and susceptible to antibiotics as well as the effect of the heatshock protein DnaK on the in vitro susceptibility of E. coli to photodynamic treatment.
In times of increasing rates of antibiotic resistances among bacteria the principle of photodynamic treatment offers a promising way to encounter infections in the future – and not just bacterial ones. Photodynamic processes have the drawback of both long incubation times of the photosensitive dye with the target structure (bacteria, viruses, fungi) and long exposure times to light, both being necessary processes for the photosensitizer to unfold a photodynamic antimicrobial effect within the incubated organisms.
Within bacteria plenty of unspecific resistance mechanisms against stress factors are known. One of them is the formation of heatshock proteins (HSPs). This class of repair proteins reconstitutes incorrectly folded proteins in order to reduce the harmful effects of the causative stressor. Expression of HSP due to photodynamic treatment has already been described. The purpose of this thesis is to investigate to what extend increased expression of HSP contributes to elevated bacterial resistance against PIB.
1.1 Flash lamp procedure with IPL
The first part of the thesis deals with the research of a short-time way to applique the light doses, that to date require long exposure times, and by which means this takes influence on the antimicrobial photodynamic effect.
Therefore, different strains of bacteria were incubated with TMPyP, a well know photosensitizer of high antimicrobial efficacy in conventional settings (long exposure time). Afterwards, the incubated bacteria were exposed to high energetic flashes of light of maximal 100 ms each via a commercial IPL flash lamp. The totally administered light dose was consistent with the light dose gained in conventional experiments in 30 ore more minutes.
After a very short incubation time of 10 s and at a concentration of the photosensitizer TMPyP of 10 µM, a exposure time of merely 83 ms revealed an antibacterial efficacy of 99,999 % within S. aureus, two different strains of MRSA and B. atrophaeus, corresponding to a reduction of 5 log10 and independently of the antibiotic resistance patterns.
Harder conditions were needed to obtain the same reductive effect within E. coli requiring a PS concentration of 100 µM and three light flashes of 100 ms each.
1.2 Heatshock response
The second part of the doctor thesis treats about the bacterial response mechanisms to photodynamic treatment. The elsewhere already well documented HSP response to various stressors was to be investigated regarding its presence and characteristic after incubation with TMPyP and subsequent irradiation.
After incubation of E. coli with 0,5 µM TMPyP and following exposure to light (sublethal photodynamic conditions) increased levels of heatshock protein DnaK could be detected by Western blotting. Comparison was ensured in reference to the simultaneous expression of the housekeeping protein GAPDH.
At a concentration of 1,0 µM TMPyP and after irradiation with 12,06 J/cm² almost no proteins at all could be detected, concentrations of housekeeping protein as well as heatshock protein were considerably reduced. As a reason for that the severe damage through generated singulett oxygen and reactive oxygen species (ROS) can be seen.
Increased expression of HSP leads to augmented resistance against oxidative stress (ROS). In this thesis elevated temperature (50 °C) did not reduce the antimicrobial effect showing an enhanced resistance against subsequent PIB (creation of oxidative stress). A reduction of more than 5 log10 could be reached.
It should be noted that no increase in expression of DnaK could be seen by means of temperature rise to 50 °C in this thesis.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 00:42
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