| License: Publishing license for publications including print on demand (13MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-309540
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 1 October 2015 |
| Referee: | Prof. Dr. Herbert Tschochner |
| Date of exam: | 7 November 2014 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III > House of the Ribosome Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III > Prof. Dr. Herbert Tschochner Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III > Dr. Philipp Milkereit |
| Keywords: | ribosome biogenesis, ribosome assembly, ribosome synthesis, quantitative mass spectrometry, RNP, ribosomal protein |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 30954 |
Abstract (English)
Ribosomes are ribonucleoprotein (RNP) particles that catalyze the translation of the genetic information of messenger RNA (mRNA) into proteins. The biogenesis of eukaryotic ribosomes is a highly complex process that starts in the nucleolus where the ribosomal RNA (rRNA) is synthesized by RNA Polymerases I and III. Three of the four rRNA molecules are produced as one precursor molecule (pre-rRNA) ...
Abstract (English)
Ribosomes are ribonucleoprotein (RNP) particles that catalyze the translation of the genetic information of messenger RNA (mRNA) into proteins. The biogenesis of eukaryotic ribosomes is a highly complex process that starts in the nucleolus where the ribosomal RNA (rRNA) is synthesized by RNA Polymerases I and III. Three of the four rRNA molecules are produced as one precursor molecule (pre-rRNA) that contains spacer sequences that are not part of mature ribosomal subunits but are removed during ribosome biogenesis. Besides these processing events, rRNA is heavily modified.
In the course of ribosome assembly, the numerous (around 80) ribosomal proteins (r-proteins) and the rRNA (precursors) join together in a highly dynamic and defined manner. Initial interactions of most of the r-proteins to preribosomes occur already in the nucleolus or in the nucleus; some seem to be incorporated in the cytoplasm where the some final maturation events happen. Most of the r-proteins are required for an efficient accumulation of functional ribosomal subunits in the cytoplasm. Interestingly, depletion of essential LSU r-proteins resulted not in one common but in several different pre-rRNA processing phenotypes indicating their requirement for specific maturation events. In vitro reconstitution experiments on prokaryotic ribosomal subunits (whose structures are highly similar to the ones of their eukaryotic counterparts) helped to analyze the hierarchical interrelationships between the individual r-protein assembly events. In eukaryotic cells, the production of ribosomal subunits does not occur in a “self assembly” mechanism but requires numerous transiently interacting proteins, the so called ribosome biogenesis factors, and many small nucleolar RNAs (snoRNAs). Most of our current knowledge on eukaryotic ribosome biogenesis comes from studies in the yeast S.cerevisiae. Highly resolved structural information of mature yeast ribosomes (which is available since a few years) contributed to a better understanding of ribosome function but also ribosome biogenesis. Although the knowledge of the binding sites of the structural components (r-proteins) in the mature ribosomal subunits might not fully reflect how these “endpoints” are established in vivo, the final structure is very helpful to better understand features like hierarchical interrelationship of r-protein assembly events and/or their requirement for specific maturation events.
In this work, the assembly process of the 46 r-proteins of the yeast large ribosomal subunit was aimed to be characterized in terms of several previously fragmentary or unresolved aspects. By comparing the respective amounts of the individual LSU r-proteins in differently maturated LSU precursors to each other and/or to the ones in mature LSUs, the assembly characteristics of each of the 46 LSU r-proteins was addressed applying a combination of affinity purification (ex vivo) and quantitative mass spectrometry. In a complementary approach, the interaction of a number of essential LSU r-proteins with the nascent particles was investigated in a comparative way by affinity purification of epitope tagged LSU r-proteins and quantitative analysis of the co-purified (pre-) rRNA species. In order to better understand the requirement of individual LSU r-proteins for certain assembly or maturation events, various LSU r-protein expression mutants were then used to investigate changes in the composition of the mutant preribosomes. Both, changes in the association of other LSU r-proteins and LSU ribosome biogenesis factors were analyzed. The results were then compared to previously published data from in vivo and in vitro experiments.
The comparative analyses on the composition of differently maturated LSU precursors indicated that most LSU r-proteins seem to already start interacting with preribosomes of early maturation stages. In average, the affinity of these initial interactions seems to be rather low, though. The binding strength of most LSU r-proteins is then stabilized in the course of ribosome maturation. Therefore, the stable incorporation of most LSU r-proteins seems to be a multistep, rather than a one step event. Some LSU r-proteins however showed a specific assembly behavior which was characterized by an underrepresentation in early (or early and intermediately) maturated LSU precursors. Their (stable) incorporation seems to occur at later stages; for one group of LSU r-proteins in the cytoplasm.
Clear evidences for hierarchical interrelationships among LSU r-protein assembly events in vivo could be deduced from the analyses of the RPL mutants. They can be categorized into two kinds of effects. One effect observed after depletion of most LSU r-proteins was characterized by a partial destabilization of the mutant preribosomes in the direct neighborhood of the depleted LSU r-protein or in the same secondary structure domain. Second, more general effects which can be related to the depletion phenotype of the respective r-protein were observed in most cases. A comparison to the results of previously published in vitro reconstitution experiments of prokaryotic LSUs revealed clear differences between the observed hierarchical interrelationships in vivo (in yeast) and in vitro (in E.coli), which are discussed. In addition, specific changes in the association of several ribosome biogenesis factors to the mutant preribosomes were observed. While in some cases the recruitment of several biogenesis factors to the preribosomes was disturbed, evidences for an inhibited release of others were provided. Altogether these results can contribute to a better understanding of the interplay between r-protein assembly events and the transient association of ribosome biogenesis factors. In addition, information of the molecular prerequisites for several maturation events, which are disturbed in the individual mutants (as pre-rRNA processing or nuclear export), can be deduced from these results.
Translation of the abstract (German)
Ribosomen sind Ribonucleoprotein (RNP) Partikel, die für die Translation der in mRNA enthaltenen genetischen Information in Proteine verantwortlich sind, indem sie die Verknüpfung der einzelnen Aminosäuren zu Proteinen katalysieren. Ihre Biogenese ist in eukaryotischen Organismen ein sehr komplexer Vorgang welcher im Nucleolus beginnt und im Zytoplasma endet. Ribosomale RNA (rRNA) wird in der ...
Translation of the abstract (German)
Ribosomen sind Ribonucleoprotein (RNP) Partikel, die für die Translation der in mRNA enthaltenen genetischen Information in Proteine verantwortlich sind, indem sie die Verknüpfung der einzelnen Aminosäuren zu Proteinen katalysieren. Ihre Biogenese ist in eukaryotischen Organismen ein sehr komplexer Vorgang welcher im Nucleolus beginnt und im Zytoplasma endet. Ribosomale RNA (rRNA) wird in der Bäckerhefe im Nucleolus von den beiden RNA Polymerasen I und III hergestellt. Drei der vier rRNA Moleküle werden nicht einzeln, sondern als zusammenhängendes Vorläufermolekül produziert, das so genannte „Spacer“ Bereiche enthält, die im Laufe der Ribosomenbiogenese entfernt werden.
Die zahlreichen (in Eukaryoten etwa 80) strukturellen Proteinkomponenten (r-Proteine) werden im Zuge der Ribosomenbiogenese in das entstehende Vorläuferribosom eingebaut. Die meisten dieser Interaktionen zwischen (Vorläufer-) rRNA und r-Proteinen beginnen wohl bereits sehr früh im Nucleolus (vielleicht schon während der Synthese der rRNA) und im Zellkern. Ein paar andere scheinen dagegen erst im Zytoplasma stabil eingebaut zu werden. Depletionsanalysen haben ergeben, dass die meisten r-Proteine für die Reifung von Vorläuferribosomen benötigt werden. Fehlen sie, so stoppt die Reifung an verschiedenen Stellen, indem beispielsweise bestimmte Vorläufer rRNAs nicht mehr prozessiert werden können. Zahlreiche in vitro Rekonstitutionsexperimente mit prokaryotischen ribosomalen Untereinheiten (deren Struktur sehr ähnlich ist) zeigten, dass einige r-Protein - Assemblierungsereignisse voneinander abhängig sind, während andere unabhängig voneinander geschehen können. Der Prozess der Ribosomenbiogenese kann in eukaryotischen Zellen nicht von selbst ablaufen, sondern benötigt zahlreiche Protein- oder RNA (snoRNA) Komponenten die im Zuge der Reifung mit den verschiedenen Vorläuferpartikeln interagieren. Sowohl der Prozess der eukaryotischen Ribosomenbiogenese als auch die Struktur reifer Ribosomen wurde am intensivsten an der Bäckerhefe (S.cerevisiae) untersucht. Detaillierte Strukturdaten reifer Ribosomen (in atomarer Auflösung) sind seit ein paar Jahren verfügbar. Diese tragen sowohl zum besseren Verständnis der Translation, als auch zum Prozess der Herstellung ribosomaler Untereinheiten bei.
Ein Ziel dieser Arbeit war, den Assemblieungsprozess der 46 r-Proteine der großen ribosomalen Untereinheit der Bäckerhefe bezüglich einiger bisher unverstandenen oder nur teilweise bekannten Aspekte zu analysieren. In einem Ansatz wurden dabei unterschiedlich weit gereifte Vorläuferribosomen aus Hefezellextrakten gereinigt und hinsichtlich ihrer Zusammensetzung miteinander verglichen. Durch quantitative Analyse der darin enthaltenen r-Proteine sollte so ermittelt werden, welche r-Proteine zu welchem Zeitpunkt der Reifung (stabil) eingebaut werden. Um die hierarchischen Beziehungen zwischen der Assemblierung einzelner r-Proteine in den Zellen zu erforschen, wurden r-Protein Expressionsmutanten verwendet, in denen einzelne r-Proteine depletiert werden können. Die Änderung in der Zusammensetzung der daraus gereinigten Vorläuferribosomen sollte Aufschluss darüber geben, welche anderen r-Proteine und/oder Biogenesefaktoren von der Assemblierung des depletierten r-Proteins abhängen. Die daraus gewonnenen Daten über hierarchische Beziehungen sollten mit bisher bekannten Daten aus in vivo und in vitro Experimenten verglichen werden. Außerdem konnten (mit Hilfe der ribosomalen Kristallstruktur) die identifizierten hierarchischen Abhängigkeiten mit den Positionen der jeweiligen r-Proteine im reifen Ribosom in Zusammenhang gebracht werden.
Die vergleichenden Studien an unterschiedlich gereiften Vorläuferpartikeln zeigten, dass die meisten r-Proteine der großen Untereinheit bereits mit sehr frühen Vorläufern interagieren können. Diese ersten Interaktionen scheinen aber eher schwach zu sein und erst im Laufe der weiteren Reifung stabilisiert zu werden. Deshalb kann der Einbau der meisten r-Proteine der großen Untereinheit als mehrstufiger Prozess betrachtet werden und weniger als ein einzelnes Ereignis. Einige r-Proteine zeigten allerdings ein deutlich anderes Assemblierungsverhalten. Sie scheinen erst mit etwas weiter gereiften (bzw. schon sehr weit gereiften, zytoplasmatischen) Vorläufern stabil zu interagieren, da sie in früheren Vorläufern nur in sehr geringem Maß vorhanden waren.
Die Analysen der mutierten Vorläuferribosomen, die aus Zellen gereinigt wurden in denen jeweils ein bestimmtes r-Protein depletiert wurde, deuteten auf klare hierarchische Beziehungen zwischen einzelnen Assemblierungsereignissen von r-Proteinen in der Zelle hin. Diese Beziehungen können zwei Kategorien zugeordnet werden. Nach Depletion der meisten r-Proteine tendierte spezifisch die Bindung jener r-Proteine geschwächt zu sein, die in der Nähe des depletierten r-Proteins binden bzw. mit derselben rRNA Sekundärstrukturdomäne interagieren. Neben diesen spezifischen „lokalen“ Effekten wurden Effekte beobachtet, die eher mit dem jeweiligen Depletionsphänotyp in Zusammenhang gebracht werden können. Betroffen waren in diesen Fällen vor allem jene r-Proteine, die normalerweise erst nach dem unterbrochenen Reifeschritt (z.B. Prozessierung von Vorläufer rRNA) stabil eingebaut werden. Verglichen mit den bisher bekannten hierarchischen Beziehungen einzelner r-Proteine, die vor allem aus in vitro Experimenten prokaryotischer r-Proteine stammen, ergaben sich klare Unterschiede, deren Ursache diskutiert wird.
Neben den r-Proteinen wurde in diesen Mutanten auch die veränderte Wechselwirkung von Ribosomenbiogenesefaktoren analysiert. Oft schien die Rekrutierung bestimmter Faktoren gestört zu sein, während in anderen Fällen die Freisetzung nicht mehr effizient funktionierte. Durch diese zusätzlichen Informationen können in vielen Fällen Assemblierung von r-Proteinen und Interaktion von Faktoren mit dem jeweiligen Reifungsereignis (z.B. Prozessierung der Vorläufer rRNA) in Zusammenhang gebracht werden, um die molekularen Voraussetzungen für dieses Ereignis besser verstehen zu können.
Metadata last modified: 02 Jun 2018 06:41
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