Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein Proteinkomplex aus I. hospitalis chromatographisch gereinigt werden, der alle Untereinheiten der ATP-Synthase/ATPase enthielt. Jedoch erwies sich dieser als sehr instabil, was unter anderem während der nativen Gelelektrophorese und der Gelfiltration deutlich wurde. Er zerfiel dabei in zwei Subkomplexe von etwa 440 kDa und 669 kDa, von denen der erste die ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein Proteinkomplex aus I. hospitalis chromatographisch gereinigt werden, der alle Untereinheiten der ATP-Synthase/ATPase enthielt. Jedoch erwies sich dieser als sehr instabil, was unter anderem während der nativen Gelelektrophorese und der Gelfiltration deutlich wurde. Er zerfiel dabei in zwei Subkomplexe von etwa 440 kDa und 669 kDa, von denen der erste die Untereinheiten A, B, E und vermutlich F und der zweite die Untereinheiten a, c, H sowie vermutlich C und D enthielt. Dies ist vergleichbar mit früheren Ergebnissen, die die gleiche Bruchstelle innerhalb der ATP-Synthase/ATPase vorhersagen. Aus diesem Grund konnten keine strukturellen Analysen mittels Elektronenmikroskopie oder Röntgenkristallographie durchgeführt werden. Bei der Reinigung erwies sich ein pH-Wert von pH 9,0 als besser geeignet im Vergleich zu früheren Arbeiten, in denen bei pH 8,0 gearbeitet wurde. Dies spiegelt vermutlich die Verhältnisse im Intermembrankompartiment wider, denen die ATP-Synthase/ATPase in vivo ausgesetzt ist. Durch Proteinfällung mit PEG 6000 konnte die gekoppelte ATP-Synthase/ATPase von I. hospitalis angereichert werden, ohne die Aktivität oder die Stabilität des Enzyms zu beeinträchtigen. Aufgrund der Anwesenheit anderer Proteine, u.a. des Thermosoms und der Hydrogenase, in der Fällungsfraktion konnten noch keine strukturellen Untersuchungen durchgeführt werden. In der c-Untereinheit von I. hospitalis wurde eine Signalsequenz identifiziert, die während der Reifung des Proteins abgespalten wird. Damit können nun konkretere Hypothesen darüber geäußert werden, wie der Transport in die OCM erfolgt.
Die ATP-Synthasen/ATPasen von I. pacificus und I. islandicus weisen vermutlich eine sehr ähnliche Struktur auf wie das Enzym von I. hospitalis, obwohl die A1-Subkomplexe im Nativgel ein unterschiedliches Laufverhalten zeigen. Immunmarkierungsversuche mit Antikörpern gegen diesen Komplex von I. pacificus blieben bislang erfolglos. Die Diskrepanz zwischen der hohen Sequenzidentität der einzelnen Untereinheiten und der schlechten Kreuzreaktion der Antikörper bleibt unklar.
Die ATP-Synthase/ATPase von N. equitans konnte nicht aus Zellextrakten der Mischkultur, von denen freie N. equitans-Zellen abgetrennt worden waren, gereinigt werden. Mit dem Nachweis der c-Untereinheit nach Chloroform/Methanol-Extraktion und dem einmaligen Nachweis von Na+-abhängiger Hydrolyseaktivität konnte jedoch die Vermutung bestärkt werden, dass das Enzym in vivo tatsächlich vorhanden ist. Es dient möglicherweise als ATPase zum Aufbau eines Ionengradienten in freien N. equitans-Zellen.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
A protein complex containing all subunits of the ATP synthase/ATPase was purified chromatographically from I. hospitalis membranes in this study. However, this complex was very unstable as it dissociated into two subcomplexes during native electrophoresis and gel filtration chromatography. One subcomplex contained the subunits A, B, E, and likely F, while the other one consisted of the subunits ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
A protein complex containing all subunits of the ATP synthase/ATPase was purified chromatographically from I. hospitalis membranes in this study. However, this complex was very unstable as it dissociated into two subcomplexes during native electrophoresis and gel filtration chromatography. One subcomplex contained the subunits A, B, E, and likely F, while the other one consisted of the subunits a, c, H, and likely C and D. Therefore, electron microscopy studies or X-ray crystallography experiments have not been possible. For the purification, a pH value of 9.0 was shown to be beneficial compared to pH 8.0 which had been used in previous studies. This likely reflects the conditions in the intermembrane compartment, which is the environment of the ATP synthase/ATPase in vivo. Protein precipitation using PEG 6000 led to the enrichment of an active and stable ATP synthase/ATPase complex from I. hospitalis. However, structural analyses could not be performed due to the presence of other proteins like the thermosome and the hydrogenase. A signal sequence was identified in the c subunit of I. hospitalis. This allows for hypotheses about the transport mechanism into the outer cellular membrane. The ATP synthases/ATPases from I. pacificus and I. islandicus likely exhibit a very similar structure as the enzyme from I. hospitalis. However, the A1 subcomplexes show different migration behavior during native electrophoresis. Immunolocalization experiments using antibodies against the A1 subcomplex from I. pacificus have not been successful. The discrepancy between the high sequence identity of the single subunits and the poor cross reactivity of the antibodies remains unclear. The ATP synthase/ATPase from N. equitans could not be purified from cell extracts of the co-culture after removing free N. equitans cells. The identification of the c subunit and the one-time proof of sodium ion dependent ATP hydrolysis activity confirmed the hypothesis of the existence of the enzyme in vivo. Possibly, it is used as an ATPase to establish an ion gradient in free N. equitans cells.
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