| License: Publishing license for publications excluding print on demand (1MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-315154
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.31515
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 27 March 2015 |
| Referee: | Prof. Dr. Marina Kreutz |
| Date of exam: | 19 March 2015 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Innere Medizin III (Hämatologie und Internistische Onkologie) |
| Keywords: | cancer, MYC, NSAID |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 31515 |
Abstract (German)
Ein veränderter Zellmetabolismus ist wesentliches Charakteristikum von Tumorzellen und trägt zu Proliferation und Progression bei. Das in etwa 30% aller Tumore dysregulierte Onkogen MYC gilt als einer der zentralen Regulatoren des Glukose- und Glutamin-Stoffwechsels. Die Deregulation dieser metabolischen Wege stellt somit eine vielversprechende Zielstruktur für die Tumortherapie ...
Abstract (German)
Ein veränderter Zellmetabolismus ist wesentliches Charakteristikum von Tumorzellen und trägt zu Proliferation und Progression bei. Das in etwa 30% aller Tumore dysregulierte Onkogen MYC gilt als einer der zentralen Regulatoren des Glukose- und Glutamin-Stoffwechsels. Die Deregulation dieser metabolischen Wege stellt somit eine vielversprechende Zielstruktur für die Tumortherapie dar.
Nicht-steroidale Antirheumatika (NSAIDs) werden schon seit längerem mit anti-tumoraler Aktivität in Zusammenhang gebracht, wobei bisher COX-spezifische Effekte als Ursache gezeigt wurden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation von MYC durch die NSAIDs Diclofenac und Diflunisal im Vergleich zu Acetylsalicylsäure analysiert.
Dabei wurde zunächst die Proteinexpression von MYC in einer Melanomzelllinie (MelIm), einer Prostatakarzinomzelllinie (PC3), einer Histiozytomzelllinie (U937) und einer Leukämiezelllinie (Jurkat) mit Hilfe von Western-Blot untersucht. Hierbei konnte sowohl bei steigenden Diclofenac- als auch bei steigenden Diflunisalkonzentrationen eine Hemmung der Proteinexpression von MYC in allen Zelllinien festgestellt werden. Eine Behandlung der Zellen mit Acetylsalicylsäure (ASS) zeigte dies jedoch nicht. Die Effekte auf Proteinebene sollten anschließend auch durch intrazelluläre Färbung von MYC mit Hilfe von direkt fluoreszenz-markierten Antikörpern untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde ein Färbeprotokoll mit verschiedenen anti-MYC Antikörpern in MelIm und U937 etabliert. Dabei konnte in beiden Zelllinien MYC mittels intrazellulärer Färbung nachgewiesen werden. Als Vergleich wurden nicht-proliferierende Monozyten verwendet, die keine MYC-Expression zeigten. In weiteren Experimenten ist zu untersuchen, ob nach Behandlung mit NSAIDs immunzytochemisch eine veränderte Expression nachgewiesen werden kann.
Nachdem auf Proteinebene eine Hemmung der Expression von MYC festgestellt werden konnte, wurde auch die Regulation auf transkriptioneller Ebene untersucht. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Reporterkonstrukte kloniert, die unterschiedlich lange Bereiche um den Hauptpromotor von MYC enthielten. Nach Transfektion in die Zelllinie MelIm und Inkubation in An- und Abwesenheit von Diclofenac und Diflunisal wurde die Promotoraktivität mittels Luziferase-Assays getestet. Diclofenac supprimierte die Transkription signifikant, während Diflunisal keinen Einfluss zeigte. Die drei unterschiedlich großen Promotorregionen ließen keinen signifikanten Unterschied erkennen.
Da MYC entscheidend die Regulation von Proliferation und Apoptose beeinflusst, wurde des Weiteren analysiert, inwieweit Diclofenac und Diflunisal Apoptose in den untersuchten Zelllinien auslösen. Mit Hilfe von durchflusszytometrischen Analysen wurde die Vitalität von MelIm und U937 nach Behandlung mit Diclofenac und Diflunisal getestet. Es konnte gezeigt werden, dass sich Diclofenac und Diflunisal bei den behandelten Zelllinien unterschiedlich verhalten. Während bei MelIm nur durch die Kombination beider NSAIDs in den höchsten Konzentrationen wesentlich Apoptose induziert werden konnte, verringerten in U937 bereits die einzelnen NSAIDs in den höchsten Konzentrationen signifikant die Vitalität der Zellen. Die Kombination von Diclofenac und Diflunisal führte in beiden Zelllinien zur deutlich verstärkten Apoptose.
Die dargestellten Arbeiten deuten an, dass Diclofenac und Diflunisal das Onkogen MYC auf unterschiedliche Weise beeinflussen. Während Diclofenac auf transkriptioneller Ebene und Proteinebene agiert, erreicht Diflunisal nur eine deutliche Hemmung der Proteinexpression. Die Tatsache, dass ASS keinen Effekt zeigt, lässt außerdem annehmen, dass es sich hierbei um Substanz-spezifische und COX-unabhängige Regulationsmechanismen handelt.
Insgesamt stellt die Beeinflussung von MYC durch NSAIDs einen vielversprechenden Ansatz für eine spezifische Tumortherapie dar, sodass Diclofenac als interessante Substanz zur Unterstützung einer Tumortherapie anzusehen ist.
Translation of the abstract (English)
A metabolic switch is one of the main characteristics of cancer cells and contributes to their proliferation and progression. The onco-gene MYC - one of the major regulators of glucose and glutamine metabolism – is in ~ 30% of human cancers deregulated. It therefore represents a very promising target for cancer therapy. For nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) anti-tumoral effects are ...
Translation of the abstract (English)
A metabolic switch is one of the main characteristics of cancer cells and contributes to their proliferation and progression. The onco-gene MYC - one of the major regulators of glucose and glutamine metabolism – is in ~ 30% of human cancers deregulated. It therefore represents a very promising target for cancer therapy.
For nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) anti-tumoral effects are discussed for some time. So far mainly COX-dependent mechanisms are shown. This paper analyses the regulation of MYC by two NSAIDS – Diclofenac and Diflunisal - in comparison to ASS.
First the protein expression of MYC was analyzed by western blotting in a human melanoma cell line (MelIm), a prostate carcinoma cell line (PC3), a human histiocytic lymphoma cell line (U937) and a T-cell leukemia cell line (Jurkat). The protein expression of MYC was inhibited by increasing concentrations of Diclofenac and Diflunisal in all cell lines. In contrast ASS showed no effect. A further method for analyzing effects on protein level is an intracellular staining by fluorescence-tagged antibodies. First a staining protocol had to be established for MelIm and U937. For both cell lines a positive staining could be observed whereas in non-proliferating monocytes without MYC expression no reaction appeared. The influence of NSAIDs on the expression remains to be investigated in further experiments.
Another point of interest was the transcriptional regulation by NSAIDs. Different constructs of variable length upstream the transcription start site were cloned and transfected into MelIm. The promotor activity was tested using the Dual-Luciferase-Reporter Assay System in presence and absence of Diclofenac and Diflunisal. Diclofenac significantly suppressed the promotor activity whereas Diflunisal showed no effect. There was no significant difference for the different lengths.
Furthermore MYC regulates proliferation and apoptosis. We therefore analyzed the influence of Diclofenac and Diflunisal on apoptosis by evaluating the vitality of MelIm and U937 cells after treatment by flow cytometric analyses (FACS). A different reaction for the two cell lines could be observed. Only the combination of both NSAIDs in the highest concentrations induced apoptosis in MelIm. For U937 also the single use of Diclofenac or Diflunisal in the highest concentration induced apoptosis significantly. The combination of both NSAIDs always showed a greater effect than the singular use.
This work shows an influence of Diclofenac and Diflunisal on the onco-gen MYC on different levels. Diclofenac suppresses the transcription and the protein expression whereas Diflunisal only affects the protein expression. The fact that ASS has no effect proposes a COX-independent mechanism.
In conclusion, MYC represents a very attractive target for specific cancer therapy and Diclofenac might be a promising anti-cancer drug supporting established therapies.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 00:13
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