| License: Publishing license for publications excluding print on demand (16MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-318545
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.31854
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 10 March 2016 |
| Referee: | Prof. Dr. Richard Warth |
| Date of exam: | 10 March 2015 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Physiologie > Prof. Dr. Richard Warth |
| Keywords: | Physiologie, Tubulopathie, Mitochondrien |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 31854 |
Abstract (German)
Das renale Fanconi-Syndrom wird definiert als Einschränkung des proximal tubulären Transports und kann durch eine Vielzahl von Faktoren ausgelöst werden. Neben sogenannten sekundären Formen als Folge einer anderen Erkrankung oder als Nebenwirkung einer therapeutischen Behandlung gibt es auch primäre Formen, die als direkte Konsequenz einer Mutation auftreten. In dieser Arbeit sollten zwei dieser ...
Abstract (German)
Das renale Fanconi-Syndrom wird definiert als Einschränkung des proximal tubulären Transports und kann durch eine Vielzahl von Faktoren ausgelöst werden. Neben sogenannten sekundären Formen als Folge einer anderen Erkrankung oder als Nebenwirkung einer therapeutischen Behandlung gibt es auch primäre Formen, die als direkte Konsequenz einer Mutation auftreten. In dieser Arbeit sollten zwei dieser Formen untersucht werden, die beide autosomal dominant vererbt werden. Zum einen handelt es sich dabei um das peroxisomale Protein EHHADH, das dort an der β-Oxidation beteiligt ist. Zum anderen um FAP2, einen Bestandteil der Kreatin-Synthese.
Für EHHADH war bereits bekannt, dass es im späten proximalen Tubulus der Niere exprimiert wird. Dieses Ergebnis wurde mit Hilfe zweier weiterer Antikörper bestätigt. Sowohl die Immunfluoreszenz mit einem weiteren Antikörper gegen EHHADH als auch mit einem Antikörper gegen das peroxisomale Protein D-Amino acid oxidase ergab ein Signal im corticalen Bereich der Niere im spät-proximalen Tubulus (S2/S3-Segment). Die beobachtete granuläre Verteilung stand im Einklang mit der Verteilung der Peroxisomen. Dies ließ den Schluss zu, dass EHHADH in den Peroxisomen des spät-proximalen Tubulus exprimiert wird. In Vorarbeiten konnte nachgewiesen werden, dass mutiertes EHHADH zusätzlich in die Mitochondrien importiert wird. Die genaue intramitochondriale Lokalisation wurde elektronenmikroskopisch mit Hilfe der ReAsH-Methode untersucht. Bei den mit EHHADHWT transfizierten Zellen waren nur die Peroxisomen positiv. In den Mitochondrien war kein Niederschlag erkennbar. Im Gegensatz dazu hatten mit EHHADHMUT transfizierte Zellen sowohl positive Peroxisomen als auch Mitochondrien. In meiner Diplomarbeit habe ich festgestellt, dass der mitochondriale Import von EHHADH eine Beeinträchtigung der oxidativen Phosphorylierung zur Folge hat. Um zu überprüfen, ob sich dies analog zu den Fanconi-Patienten tatsächlich auf den transzellulären Transport auswirkt, wurde auf Filtern gewachsenen Zellen das Glucose-Derivat α-D-Methylglucosid angeboten. Dies wird von Na+-Glucose-Cotransportern transportiert, in den Zellen jedoch nicht umgesetzt. Dabei zeigte sich, dass die EHHADHMUT-Zellen nur rund ein Viertel der Transportkapazität der Wildtypzellen hatten.
Diese Daten erlauben nun neue Einblicke in die Pathogenese dieses speziellen Fanconi-Syndroms. EHHADHMUT wird fälschlicherweise in die Mitochondrien importiert, wo es die mitochondriale β-Oxidation beeinträchtigt. Dies führt schlussendlich zu einer verringerten ATP-Synthese und einer erniedrigten Transportkapazität im proximalen Tubulus der betroffenen Patienten.
Bei FAP2 handelt es sich im Gegensatz zu EHHADH um ein genuines mitochondriales Protein. Die Lokalisation in der Niere konnte auf den frühen proximalen Tubulus eingegrenzt werden, wo es in den Mitochondrien lokalisiert war. Spät-proximale Tubuli sowie medulläre Segmente waren negativ für FAP2. Mit Hilfe einer stabil transfizierten Zelllinie wurde eine Mutation im FAP2-Gen näher untersucht. Zellen, welche FAPWT überexprimierten, wiesen einen relativ milden Phänotyp auf. Die Mitochondrien erschienen fragmentiert und geschwollen, was in der Elektronenmikroskopie bestätigt wurde. Dies ist vermutlich der Überexpression von FAP2WT und dem damit verbundenen vermehrten Import von FAP2WT in die Mitochondrien geschuldet. Zellen, die FAP2MUT überexprimierten, enthielten massiv veränderte Mitochondrien. Die Mitochondrien waren stark elongiert und durchzogen die gesamte Zelle. In der Elektronenmikroskopie waren in den Mitochondrien der FAP2MUT-Zellen filamentartige Strukturen erkennbar. Mit Hilfe der Immuno-Gold-Markierung konnte die Beteiligung von FAP2MUT am Aufbau der Filamente nachgewiesen werden. Die Halbwertszeit des mutierten FAP2-Proteins war drastisch verlängert. Dies deutet darauf hin, dass das in Filamenten befindliche FAP2MUT-Protein nicht mehr normal degradiert werden konnte. Trotz der massiv veränderten Mitochondrienmorphologie konnte in respiratorischen Messungen der oxidativen Phosphorylierung kein deutlicher Unterschied zwischen FAP2WT- und FAP2MUT-Zellen beobachtet werden. Das Fanconi-Syndrom scheint bei diesen Patienten also nicht durch eine Einschränkung der Energiebereitstellung verursacht zu werden.
Zudem konnte eine Biopsie einer Patientenniere untersucht werden. Eine Hämalaun/Eosin-Färbung ergab gut erhaltene distale Segmente und Glomeruli. Die proximalen Abschnitte Zeichen einer tubulären Schädigung. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen waren in den proximalen Tubuluszellen ebenfalls Riesenmitochondrien erkennbar, die filamentartige Einschlüsse enthielten.
Diese Befunde legen nahe, dass das Auftreten der intramitochondrialen Ablagerungen kein Zellkulturartefakt ist, sondern diese filamentartigen Strukturen auch in vivo am Entstehen der Erkrankung beteiligt sind. Das beobachtete Fanconi-Syndrom sowie die Niereninsuffizienz scheinen jedoch nicht die Folge einer beeinträchtigten oxidativen Phosphorylierung zu sein. Der zu Grunde liegende Pathomechanismus konnte jedoch noch nicht aufgeklärt werden.
Die in dieser Arbeit untersuchten Formen des renalen Fanconi-Syndroms entstehen beide in Folge einer Mitochondriopathie. Während im Falle der EHHADH-Mutation eine verminderte Energiebereitstellung krankheitsauslösend zu sein scheint, sind die Pathomechanismen bei FAP2 komplexer und bedürfen weiterführender Untersuchungen, für die die hier dargestellten Befunde eine Ausgangsbasis bilden.
Translation of the abstract (English)
Renal Fanconi syndrome is defined as an impaired transport capacity of the proximal tubule and can be caused by a variety of factors. Besides secondary Fanconi syndromes caused by another disease or as side effects of medication primary forms exist as a consequence of a mutation. Here, two distinct forms of renal Fanconi syndrome are described which are both inherited in an autosomal dominant ...
Translation of the abstract (English)
Renal Fanconi syndrome is defined as an impaired transport capacity of the proximal tubule and can be caused by a variety of factors. Besides secondary Fanconi syndromes caused by another disease or as side effects of medication primary forms exist as a consequence of a mutation. Here, two distinct forms of renal Fanconi syndrome are described which are both inherited in an autosomal dominant fashion. Firstly, EHHADH, a protein involved in peroxisomal β-oxidation, and secondly FAP2, a component of creatine synthesis.
EHHADH was already known to be expressed in the late proximal tubule. This was confirmed by staining with two commercial antibodies, one staining for EHHADH and another staining for the peroxisomal protein D-amino acid oxidase. In both cases, a positive staining was visible in the kidney cortex in the late proximal tubule (S2/S3 segment). The observed granular staining was consistent with peroxisomal localization. I therefore concluded that EHHADH is expressed in peroxisomes of the late proximal tubule of the kidney. Previous experiments indicated that mutated EHHADH is also imported into the mitochondria. Intramitochondrial localization was evaluated electron microscopically using the ReAsH method. In EHHADHWT-transfected cells only the peroxisomes were positive. No electron-dense precipitates were visible in mitochondria. In contrast, in EHHADHMUT-transfected cells both peroxisomes and mitochondria were positive. In my diploma thesis I could already determine that mitochondrial import of EHHADHMUT leads to a decreased activity of oxidative phosphorylation. To evaluate if this affects transcellular transport α-D-methyl glucoside was added to the medium of cells which were grown on filters. This glucose derivative is transported but not metabolized by cells. Transport in EHHADHMUT-expressing cells was reduced to 25% of the capacity of EHHADHWT-expressing cells.
These data reveal new insights into the pathogenesis of this form of Fanconi syndrome. Mutated EHHADH is mistargeted to the mitochondria where it interferes with mitochondrial β-oxidation. This in turn leads to a decreased ATP production and subsequently to an impaired transepithelial transport capacity in the proximal tubule of affected patients.
By contrast, FAP2 is a genuine mitochondrial protein. Expression in human kidney could be narrowed down to the proximal tubule where it was localized in the mitochondria. Late proximal tubules as well as medullary regions were negative for FAP2. A mutation in the gene coding for FAP2 was investigated closer using a stably transfected cell line. Cells overexpressing wildtype FAP2 showed a mild phenotype. Mitochondria appeared bloated and fragmented, which is most likely caused by overexpression and the resulting increased mitochondrial import of the protein. This was also confirmed by electron microscopy. Mitochondria of cells overexpressing FAP2MUT clearly showed elongated mitochondria throughout the entire cell. Electron microscopy revealed filament-like intramitochondrial deposits. Immuno-gold labelling revealed FAP2MUT to be a component of these filaments. Half-life of FAP2MUT was greatly increased indicating an impaired degradation of FAP2MUT-containing filaments. Despite the severe changes in mitochondrial morphology no difference was observed in respiratory measurements of the oxidative phosphorylation between FAP2WT and FAP2MUT cells. The observed Fanconi syndrome doesn’t appear to be caused by an impaired energy provision.
Furthermore, a biopsy of a patient’s kidney was examined. HE staining revealed well preserved glomeruli and distal segments. In contrast, proximal segments showed signs of tubular damage. Electron microscopical images showed evidence of giant mitochondria with intramitochondrial filament-like inclusions. These results suggest that these filaments are no cell culture artefacts but are rather involved in the in vivo pathogenesis. The observed Fanconi syndrome and subsequent renal failure does not appear to be caused by decreased oxidative phosphorylation. However, the underlying pathomechanism has yet to be elucidated.
Both forms of Fanconi syndrome described in this thesis develop due to mitochondriopathies. While in the case of mutated EHHADH a decreased energy provision causes the disease, the underlying pathomechanisms of FAP2MUT are more complex and require further investigation.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 23:58
Owner only: item control page
Download Statistics