The conformational equilibrium between folded and unfolded protein structures is sensitive to the presence of cosolvents in the surrounding solution, and several small organic molecules are known to modulate the functioning of proteins in cells by shifting the equilibrium toward folded (stabilizers) or unfolded states (denaturants). The molecular mechanisms behind these effects are not yet fully understood and are a matter of intense research. In the past, successful models have been devised which predict the effects of cosolvents on proteins on the basis of their effects on small model compounds. E. g., in the popular transfer model (TM) the latter are quantified by the free energies of the transfer (TFEs) of the model compounds between water and cosolvent solutions. In this thesis, we examine and discuss the interpretation and measurement of TFEs. Moreover, we deal with the application of TFE-based bottom-up approaches in the study of the denaturing mechanism of urea—the probably most studied and nonetheless most controversially discussed cosolvent. The highlights of this work are:

• We present a detailed and comprehensible explanation for the role of the concentration scale in the definition of TFEs and show that only the TFE that is defined in the molarity scale can be interpreted directly in terms of favorable or unfavorable solute-solvent interactions.

• We uncover an inconsistency and a compensating error in the nowadays established implementation of the TM. After their revision, the TM predicts that both the protein backbone and the side chains play a role in denaturation by urea. This is in line with many recent studies and thus paves the way toward a unified understanding of urea’s denaturing mechanism. Previous applications of the TM predicted a contrasting mode of action and this discrepancy was considered a major concern.

• We present a molecular dynamics study which provides further insight into urea’s denaturing mechanism. It suggests that protein denaturation by urea is the resultant of a complex and subtle interplay of various types of interactions between all solution components, being the protein, urea, and water.

• We propose a new measuring method for the determination of TFEs for transfers between pure and mixed solvents and point out that it is necessary to reassess the accuracies of currently employed measuring approaches. First steps into that direction suggest that some currently used measuring methods might not be as accurate as presumed so far.

Das Konformationsgleichgewicht zwischen gefalteten und ungefalteten Proteinstrukturen wird durch das Vorhandensein von Kosolvenzien in der umgebenden Lösung beeinflusst und einige niedermolekulare organische Moleküle sind dafür bekannt, die Funktionsfähigkeit von Proteinen in Zellen zu modulieren, indem sie das Gleichgewicht in Richtung gefalteter (Stabilisatoren) oder entfalteter Zustände (Denaturanzien) verschieben. Die molekularen Mechanismen, die diesen Effekten zugrunde liegen, sind noch nicht vollkommen verstanden und sind Gegenstand intensiver Forschung. In der Vergangenheit wurden erfolgreiche Modelle entwickelt, die Kosolvenseffekte auf Proteine anhand von Kosolvenseffekten auf kleine Modellmoleküle vorhersagen. Im bekannten Transfer-Modell (TM) werden die letzteren durch die freien Energien des Transfers (Transfer-freie-Energien, TFEs) der Modellmoleküle zwischen Wasser und Kosolvenslösungen quantifiziert. In der vorliegenden Dissertationsschrift untersuchen und diskutieren wir die Interpretation und Messung von TFEs. Darüber hinaus beschäftigen wir uns mit TFE-basierten Bottom-up-Ansätzen zur Untersuchung des Denaturierungsmechanismus von Harnstoff – dem vermutlich am meisten untersuchten und nichstdestotrotz am kontroversesten diskutierten Kosolvens. Die Höhepunkte dieser Arbeit sind:

• Wir präsentieren eine detaillierte und verständliche Erklärung für die Rolle der Konzentrationsskala bei der Definition von TFEs und zeigen, dass nur die TFE, die in der Molaritätsskala definiert ist, direkt in Form von günstigen oder ungünstigen Solut-Lösungsmittel-Wechselwirkungen interpretiert werden kann.

• Wir decken eine Inkonsistenz und einen kompensierenden Fehler in der heutzutage etablierten Implementierung des TMs auf. Nach ihrer Berichtigung sagt das TM vorher, dass sowohl das Proteinrückgrat als auch die -seitenketten bei der Denaturierung durch Harnstoff eine Rolle spielen. Das ist in Einklang mit vielen aktuellen Studien und ebnet somit den Weg zu einem einheitlicheren Verständnis des Denaturierungsmechanismus von Harnstoff. Vorherige Anwendungen des TMs sagten einen gegensätzlichen Wirkmechanismus vorher und die Klärung dieser Diskrepanz wurde als wichtige Herausforderung angesehen.

• Wir präsentieren eine Molekulardynamikstudie, welche weitere Einblicke in den Denaturierungsmechanismus von Harnstoff bietet. Sie deutet darauf hin, dass die Proteindenaturierung durch Harnstoff das Ergebnis eines komplizierten und subtilen Wechselspiels vieler verschiedener Wechselwirkungsarten zwischen allen Lösungsmittelkomponenten ist, zu denen das Protein, der Harnstoff und das Wasser gehören.

• Wir schlagen eine neue Messmethode für die Bestimmung von TFEs für Transfere zwischen reinen und gemischten Lösungsmitteln vor und weisen darauf hin, dass es notwendig ist, die Genauigkeit von momentan verwendeten Messverfahren zu überprüfen. Erste Schritte in diese Richtung deuten darauf hin, dass einige derzeit verwendete Messmethoden möglicherweise nicht so exakt sind wie bisher angenommen wurde.