| License: Publishing license for publications excluding print on demand (24MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-319790
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.31979
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 24 June 2015 |
| Referee: | Prof. Dr. Joachim Wegener |
| Date of exam: | 12 June 2015 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Bioanalytik und Biosensorik (Prof. Joachim Wegener) |
| Keywords: | single molecule experiment, enzymes, fluorescence microscopy |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 31979 |
Abstract (English)
The aim of this thesis was the analysis of individual enzyme molecules in large arrays of homogeneously arranged femtoliter-sized reaction chambers. The implementation of single molecule technologies in bioanalytical research provides us with new insights into the basic principles of life, revealing interesting details of biomolecular interactions. Thus, different conformational states or ...
Abstract (English)
The aim of this thesis was the analysis of individual enzyme molecules in large arrays of homogeneously arranged femtoliter-sized reaction chambers. The implementation of single molecule technologies in bioanalytical research provides us with new insights into the basic principles of life, revealing interesting details of biomolecular interactions. Thus, different conformational states or enzymatic subpopulations that were hidden in conventional bulk experiments are disclosed. Large arrays of homogeneous microwells are a convenient and versatile platform for monitoring the activity of many individual enzyme molecules in parallel. Entrapment of individual enzyme molecules in femtoliter-sized reaction chambers spares surface immobilization and allows for a kinetic investigation of enzymes free in solution. Additionally, the high degree of parallelization enables the investigation of a statistically representative enzyme population.
The first part of this work discusses the implementation of a novel, optimized setup for single enzyme molecule analysis in large, homogeneous arrays of femtoliter-sized reaction chambers. The generation, characterization and application of two different types of arrays etched into the surface of fused silica slides or molded in PDMS is presented. The gradual improvement of the applied experimental setup is described, considering aspects, such as tight array sealing, photobleaching, signal readout and non-specific adsorption. Ultimately, an optimized setup was achieved that enabled highly sensitive and accurate single enzyme molecule experiments. The effectivity of the designed setup was verified in the single molecule investigation of the model enzyme β-galactosidase. Several hundred enzyme molecules were individualized in the wells of both femtoliter arrays and their individual substrate turnover recorded over time by fluorescence microscopy. A broad activity distribution within the probed β-galactosidase population was detected for both experiments in fused silica and PDMS femtoliter arrays, which is in good agreement with previous reports.
In the next chapter, the femtoliter array setup was employed to gain a single molecule perspective on the mechanisms that drive the evolution of new enzyme activity. For this purpose we investigated and compared the kinetics of wild-type and in vitro evolved β-glucuronidase (GUS) at the single molecule level. Several hundred GUS molecules were individualized in the wells of fused silica femtoliter arrays and their individual substrate turnover rates observed in parallel by fluorescence microscopy. Individual GUS molecules exhibited distinct, long-lived activity states, whereas their mean activity was consistent with classical Michaelis-Menten kinetics. In comparison to the wild-type enzyme, the partially evolved variant (also called generalist) displayed a much broader activity distribution, indicating a higher conformational plasticity. This finding was confirmed by circular dichroism. The broader conformational heterogeneity of the partially evolved GUS indicates a functional division of work between individual molecules in a population of generalists, which are characterized by their promiscuous activity with many different substrates.
Finally, the established femtoliter array platform was introduced to a different, more recent application: Large arrays of homogeneously arranged microwells in combination with enzymatic signal amplification enable the digital readout of target concentrations way below the detection limit of conventional assays. In context of this thesis, the applicability of fused silica femtoliter arrays for digital concentration readout was demonstrated in a proof of principle experiment with β-galactosidase. Subsequently, the surface of fused silica arrays was modified to enable their application in bioanalytical assays. Biomolecules such as peptides or antibodies were covalently linked to the surface of the fused silica wells, using either click chemistry or common peptide chemistry. Thus, the foundation for the future application of fused silica femtoliter arrays in ultra-sensitive bioassays with digital concentration readout was laid.
Translation of the abstract (German)
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung individueller Enzymmoleküle in großen Arrays aus homogen angeordneten Kammern im Femtoliter-Maßstab. Die Etablierung von Einzelmolekültechniken in der bioanalytischen Forschung eröffnet uns neue Erkenntnisse zu den grundlegenden Prozessen des Lebens. Faszinierende Details zu intermolekularen Wechselwirkungen werden sichtbar gemacht und ...
Translation of the abstract (German)
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung individueller Enzymmoleküle in großen Arrays aus homogen angeordneten Kammern im Femtoliter-Maßstab. Die Etablierung von Einzelmolekültechniken in der bioanalytischen Forschung eröffnet uns neue Erkenntnisse zu den grundlegenden Prozessen des Lebens. Faszinierende Details zu intermolekularen Wechselwirkungen werden sichtbar gemacht und Protein-Konformationen oder Sub-populationen aufgedeckt, die in konventionellen Bulk-Experimenten verborgen geblieben sind. Der Einsatz großer Arrays aus homogen angeordneten Mikrokavitäten ist eine exzellente und vielseitige Methode zur gleichzeitigen Analyse einer großen Anzahl individueller Enzyme. Der Einschluss einzelner Enzymmoleküle in individuellen Gefäßen erübrigt eine Oberflächenimmobilisierung und erlaubt eine direkte Untersuchung frei in Lösung. Zusätzlich ermöglicht der hohe Grad an Parallelisierung die Analyse einer statistisch repräsentativen Enzympopulation.
Im ersten Teil dieser Arbeit wird die Entwicklung eines neuen, optimierten Systems zur Einzelenzymmoleküldetektion in homogenen Arrays aus Femtolitergefäßen diskutiert. Dabei wird zunächst die Herstellung und Charakterisierung zweier unterschiedlicher Array-Typen, gefertigt in Quarzglas beziehungsweise PDMS, vorgestellt. Anschließend wird die schrittweise Optimierung des experimentellen Aufbaus erläutert, wobei wesentliche Punkte, wie ein dichter Array-Verschluss, Fotobleichen, Signal-Auslesung und unspezifische Bindung berücksichtigt wurden. Auf diese Weise konnte ein optimiertes System entwickelt werden, das die Durchführung von hochempfindlichen Einzelenzymmessungen ermöglicht. Die Funktionsfähigkeit des entwickelten Systems wurde anhand einer Einzelmolekülanalyse des Modellenzyms β-Galactosidase sichergestellt. Einige hundert Enzymmoleküle wurden in den einzelnen Kammern beider Arrays isoliert und ihr jeweiliger Substratumsatz mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops aufgezeichnet. Dabei wurde für beide Arraytypen - und in guter Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen - eine breite Verteilung der Enzymaktivitäten innerhalb der β-Galactosidase-Population festgestellt.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden Femtoliterarrays aus Quarzglas eingesetzt, um die Mechanismen der Enzymevolution aus dem Blickwinkel der Einzelmolekülanalytik zu betrachten. Für diesen Zweck wurde die Kinetik einer Wildtyp- und einer in vitro entwickelten β-Glucuronidase (GUS) auf der Einzelmolekülebene untersucht und verglichen. Mehrere hundert GUS Moleküle wurden in den Kammern eines Quarzglas Arrays isoliert und ihr jeweiliger Substratumsatz parallel mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Individuelle GUS Moleküle wiesen unterschiedliche, langlebige Aktivitäts-zustände auf, wobei ihre mittlere Aktivität mit der klassischen Michaelis-Menten-Kinetik übereinstimmte. Im Vergleich zum Wildtyp-Enzym, zeigte die Mutante (oder Generalist) eine deutlich breitere Aktivitätsverteilung, was auf eine stärkere strukturelle Plastizität hindeutet. Dieses Ergebnis konnte durch eine Circulardichroismus Studie bestätigt werden. Die stärkere strukturelle Heterogenität der GUS Mutante deutet auf eine funktionelle Arbeitsteilung zwischen den einzelnen Individuen der Population hin.
Im letzten Kapitel dieser Arbeit, wurde der Quarzglas Femtoliter-Array für eine andere, aktuelle Anwendung der Einzelenzymdetektion eingesetzt: Arrays homogen angeordneter Femtoliter-Kammern in Kombination mit enzymatischer Signalverstärkung ermöglichen das digitale Auslesen von Analytkonzentrationen deutlich unterhalb der Nachweisgrenze konventioneller Assays. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst die Eignung des Quarzglas-Femtoliter Arrays für die digitale Konzentrationsbestimmung demonstriert. Anschließend wurde die Oberfläche, der Arrays derart modifiziert, dass sie in bioanalytischen Assays zur Anwendung kommen können. Unter Verwendung von Click-Chemie oder gewöhnlicher Peptid-Chemie wurden Biomoleküle wie Peptide oder Antikörper kovalent an der Oberfläche der winzigen Quarzglasgefäße immobilisiert. Auf diese Weise wurde die Grundlage für eine Anwendung der Femtoliter-Arrays in hoch-empfindlichen Assays mit digitaler Konzentrationsbestimmung geschaffen.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 23:53
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