Investigation of bioanalytical methodologies for the detection of different analytes

URN zum Zitieren dieses Dokuments:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-322713
DOI zum Zitieren dieses Dokuments:: 10.5283/epub.32271

Zanni, Thomas

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Veröffentlichungsdatum dieses Volltextes: 01 Aug 2016 06:10

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Dokumentenart:	Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation)
Open Access Art:	Primärpublikation
Datum:	1 August 2016
Begutachter (Erstgutachter):	Prof. Dr. Burkhard König
Tag der Prüfung:	10 Juli 2015
Institutionen:	Chemie und Pharmazie > Institut für Organische Chemie > Lehrstuhl Prof. Dr. Burkhard König
Stichwörter / Keywords:	liposomes, sensors, bioanalytics
Dewey-Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Status:	Veröffentlicht
Begutachtet:	Ja, diese Version wurde begutachtet
An der Universität Regensburg entstanden:	Ja
Dokumenten-ID:	32271

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Zusammenfassung (Englisch)

Zusammenfassung (Englisch)

In chapter 1, we give a short background on the vesicular chemosensors developed in the König group as introduction to the following chapters.
The chapter 2 deals with the investigation of a bis (zinc-cyclen)-biotin conjugate as a selective probe for detection of phosphorylated proteins in western blot analysis. The probe was employed in an assay scheme analogue to a standard immunodetection assay, in which the probe was used instead of the primary antibody. A number of different conditions were varied in order to optimize the performances of the assay (such as incubation and washing times, concentrations of the components in the different steps of the procedures, blocking agents). With optimized conditions, phosphorylated α-s1-casein in the µg range was detected with good selectivity towards the non-phosphorylated control proteins.
In chapter 3, we attempted to transfer the concepts developed so far in the König group in the field of vesicular chemosensors to the SPR and QCM techniques. The main goals were to characterize, and possibly to use for further applications, the binding of analytes to artificial receptor doped membranes with SPR and/or QCM. Different approaches were investigated, such as the binding of analytes to functionalized membranes which are supported on the sensor surface, the binding of the receptor doped vesicles to analyte functionalized surfaces as well as a displacement assay using gold nanoparticles. All the investigated systems showed a large unspecific interaction between the analytes and the functionalized membranes, which prevented the further development of the project.
Chapter 4 deals with the fluorescence microscopy characterization of vesicular chemosensors. Phospholipid vesicles with embedded artificial bis (zinc-cyclen) receptor together with the dye MC540 were investigated as vesicular chemosensors for different anions and subsequently characterized by high resolution STORM fluorescence microscopy and classic TIRF microscopy. The high resolution approach did not provide information about the spatial organization of the embedded molecules. With TIRFM characterization of giant unilamellar vesicles of the same composition, it was possible to observe a non-homogeneous distribution of the dyes on the surface of the vesicles, which supports the hypothesized working mechanism for the vesicular chemosensors.
Finally, in chapter 5, we reported the investigation of vesicular systems for the detection of β-lactamases and the monitoring of their activity. Different approaches were studied investigated: a dye-encapsulating liposome assay, an assay where a reporting dye and an ampicillin derivative are co-embedded in the vesicular system and a third scheme in which the dye is embedded in the liposomes while the ampicillin remains in solution. All three approaches suffered from an insufficient reproducibility which led to difficulties in the interpretation of the experimental data.

Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)

In Kapitel 1 geben wir als Einleitung zu den folgenden Abschnitten einen kurzen Hintergrund zu auf Vesikeln basierenden Chemosensoren, die in der Arbeitsgruppe König entwickelt wurden.
Kapitel 2 der Dissertation beschreibt die Untersuchung eines Bis-(Zink-Cyclen)-Biotin Konjugats, welches als selektive Sonde zur Detektion von phosphorylierten Proteinen im Rahmen der Western Blot-Analyse eingesetzt wurde. Der Aufbau des Assays entsprach dem der üblichen immunologischen Nachweisverfahren, wobei hierbei die Sonde anstatt eines primären Antikörpers eingesetzt wurde. Eine Reihe unterschiedlicher Bedingungen wurde getestet (wie zum Beispiel die Inkubationszeit, die Dauer der Waschvorgänge, die Konzentrationen der Komponenten in den verschiedenen Ablaufschritten und die Verwendung von Blockierungsmitteln) um die Genauigkeit des Assays zu verbessern. Mit den optimierten Bedingungen wurde phosphoryliertes α-s1-Casein im Mikrogrammbereich mit guter Selektivität gegenüber nichtphosphorylierten Kontrollproteinen nachgewiesen.
Im Rahmen von Kapitel 3 versuchten wir die in der Arbeitsgruppe König entwickelten Konzepte auf dem Gebiet der Vesikel-basierten Chemosensoren auf SPR- und QCM-Methoden zu übertragen. Die vorrangigen Ziele waren die Charakterisierung von Analytbindungen an mit künstlichen Rezeptoren modifizierten Membranen mittels SPR und/oder QCM sowie falls möglich der Einsatz dieser Techniken für weitere Anwendungen. Verschiedene Ansätze wurden in diesem Zusammenhang erforscht, so zum einen die Bindung von Analyten an funktionalisierten Membranen, die auf die Sensoroberfläche aufgebracht worden waren, zum anderen die Bindung von Rezeptor-modifizierten Vesikeln an Oberflächen, welche mit dem Analyten funktionalisiert worden waren. Überdies wurde ein Verdrängungsassay unter Verwendung von Goldnanopartikeln getestet. Alle untersuchten Systeme zeigten eine große unspezifische Wechselwirkung zwischen den Analyten und den funktionalisierten Membranen, was die weitere Entwicklung des Projekts einschränkte.
Kapitel 4 behandelt die Charakterisierung von Vesikel-basierten Chemosensoren mittels Fluoreszenzmikroskopie. Phospholipidvesikel mit zusammen eingelagertem künstlichen Bis-(Zink-Cyclen)-Rezeptor und Farbstoff MC540 wurden hinsichtlich ihrer Eignung als Chemosensoren für verschiedene Anionen untersucht. Anschließend wurden diese mittels hochauflösender STORM Fluoreszenzmikroskopie und klassischer TIRF Mikroskopie charakterisiert. Unter Verwendung der hochauflösenden Methode konnten keine Informationen über die räumliche Strukturierung der eingebetteten Moleküle erhalten werden. Durch die Charakterisierung von unilamellaren Riesenvesikeln (GUVs) der gleichen Zusammensetzung mit Hilfe von TIRFM wurde eine nichthomogene Verteilung der Farbstoffe auf der Oberfläche der Vesikel beobachtet, was für das postulierte Funktionsprinzip der vesikulären Chemosensoren spricht.
In Kapitel 5 berichteten wir schließlich über Studien an Vesikelsystemen zur Detektion von β-Lactamasen und der Verfolgung ihrer Aktivität. Unterschiedliche Vorgehensweisen wurden hierbei getestet: ein Assay basierend auf Farbstoff-einkapselnden Liposomen, ein Format, in dem ein Reporterfarbstoff und ein Ampicillinderivat zusammen in ein Vesikelsystem eingelagert worden waren und ein drittes Verfahren, in dem nur der Farbstoff in die Lipsomen eingebettet worden war, während das Ampicillin in Lösung verblieb. Alle drei Ansätze wiesen eine mangelhafte Reproduzierbarkeit auf, was zu Schwierigkeiten bei der Interpretation der experimentellen Daten führte.

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