Argonaute (Ago) proteins interact with small non-coding RNAs, which guide them to complementary target RNAs to mediate gene silencing. The domain organization of Ago proteins clearly reflects their function. The ends of the small RNA are bound by the Mid and PAZ domains and the structure of the PIWI domain closely resembles that of the endonuclease RNase H. Indeed, some Ago proteins can cleave ...
Zusammenfassung (Englisch)
Argonaute (Ago) proteins interact with small non-coding RNAs, which guide them to complementary target RNAs to mediate gene silencing. The domain organization of Ago proteins clearly reflects their function. The ends of the small RNA are bound by the Mid and PAZ domains and the structure of the PIWI domain closely resembles that of the endonuclease RNase H. Indeed, some Ago proteins can cleave perfectly complementary target RNAs. Here, the endonucleolytically inactive human Ago proteins Ago1, Ago3, and Ago4 were mutated to yield minimally changed, catalytically active proteins. The generation of these mutants revealed several features that are important for Ago cleavage activity, in particular two regions in the N-terminal domain and two structural elements in the catalytic domain. The identification of these structural requirements contributes essentially to our understanding of Ago-mediated silencing activity.
Ago proteins not only cleave their targets. In case of partial complementarity between small RNA and target RNA, they recruit additional factors to mediate gene silencing. Here, predominant mechanisms are translational repression and reduction of target stability. Considering the wide spectrum of gene regulation emanating from Ago proteins, it is important to understand how the proteins are regulated themselves. Here, post-translational modifications, in particular phosphorylations, of Ago proteins were analyzed by mass spectrometry. Multiple endogenous phosphorylation sites of Ago2 and its paralogues were detected. Among them are sites, which are organized in phosphorylation clusters. The data generated in this thesis represents a valuable resource for future analyses of Ago proteins and their modifying enzymes, which will provide insights into the interplay of small RNA-guided gene silencing and signaling pathways.
The phosphorylation sites analyzed here were identified on endogenous Ago proteins. To provide large amounts of endogenous protein, a novel, peptide-based purification strategy was established. Ago Affinity Purification by Peptides (Ago-APP) is based on the interaction of Ago proteins with a conserved binding partner, a member of the GW182 protein family. Therefore, the approach purifies all four human Ago proteins and can even be applied species-independently. Ago-APP represents a powerful tool for the characterization of diverse Ago complexes at the levels of protein, small RNA, and target RNA.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Argonaute-(Ago-)Proteine interagieren mit kleinen, nicht-codierenden RNAs, welche sie zu komplementären Ziel-RNAs leiten, um Genrepression zu vermitteln. Die Domänenorganisation von Ago-Proteinen spiegelt deren Funktion deutlich wider. Die Enden der kleinen RNA werden durch die Mid- und PAZ-Domänen gebunden und die Struktur der PIWI-Domäne ähnelt stark der der Endonuklease RNase H. Tatsächlich ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Argonaute-(Ago-)Proteine interagieren mit kleinen, nicht-codierenden RNAs, welche sie zu komplementären Ziel-RNAs leiten, um Genrepression zu vermitteln. Die Domänenorganisation von Ago-Proteinen spiegelt deren Funktion deutlich wider. Die Enden der kleinen RNA werden durch die Mid- und PAZ-Domänen gebunden und die Struktur der PIWI-Domäne ähnelt stark der der Endonuklease RNase H. Tatsächlich können einige Ago-Proteine perfekt komplementäre Ziel-RNAs schneiden. Hier wurden Mutationen in die endonukleolytisch inaktiven humanen Ago-Proteine Ago1, Ago3 und Ago4 eingeführt, um minimal veränderte, katalytisch aktive Proteine zu erhalten. Mit Hilfe dieser Mutanten wurden mehrere strukturelle Merkmale identfiziert, die wichtig für die Spalt-Aktivität der Proteine sind, insbesondere zwei Regionen in der N-terminalen Domäne und zwei strukturelle Elemente in der katalytischen Domäne. Die Identifikation dieser strukturellen Voraussetzungen trägt essentiell zu unserem Verständnis der durch Ago-Proteine vermittelten Genrepressions-Aktivität bei.
Ago-Proteine spalten ihre Ziel-RNAs nicht nur. Im Falle teilweiser Komplementarität zwischen kleiner RNA und Ziel-RNA rekrutieren sie zusätzliche Faktoren, um die Genexpression negativ zu beeinflussen. Vorherrschende Mechanismen sind hierbei translationale Repression und die Verminderung der mRNA-Stabilität. Angesichts des breiten Spektrums Ago-vermittelter Genregulation ist es wichtig zu verstehen, wie diese Proteine selbst reguliert werden. Hier wurden massenspektrometrische Methoden angewendet, um post-translationale Modifikationen, speziell Phosphorylierungen, von Ago-Proteinen zu untersuchen. Zahlreiche endogene Phosphorylierungsstellen von Ago2 und seinen Paralogen wurden detektiert. Darunter befinden sich Modifikationsstellen, welche in Phosphorylierungs-Clustern organisiert sind. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Daten sind eine wertvolle Informationsquelle für zukünftige Analysen von Ago-Proteinen und deren modifizierenden Enzymen, welche Einblicke in das Zusammenspiel der durch kleine RNAs vermittelten Genrepression mit Signalwegen geben werden.
Die hier analysierten Phosphorylierungsstellen wurden in endogenen Ago-Proteinen identifiziert. Um große Mengen endogener Proteine bereitzustellen, wurde eine neuartige, Peptid-basierte Aufreinigungsstrategie etabliert. Ago Affinity Purification by Peptides (Ago-APP, "Ago-Affinitätsreinigung durch Peptide") basiert auf der Interaktion von Ago-Proteinen mit einem konservierten Bindungpartner, einem Mitglied der GW182-Proteinfamilie. Daher reichert die beschriebene Aufreinigungsmethode alle vier humanen Ago-Proteine an und kann darüber hinaus Spezies-unabhängig angewendet werden. Ago-APP stellt ein leistungsfähiges Hilfsmittel für die Charakterisierung verschiedener Ago-Komplexe auf den Ebenen von Protein, kleiner RNA und Ziel-RNA dar.
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