| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen mit Print on Demand (6MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-324285
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.32428
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 22 Juni 2016 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Wolfgang Seufert |
| Tag der Prüfung: | 22 Juni 2015 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Cell Cycle Control > Prof. Dr. Wolfgang Seufert |
| Stichwörter / Keywords: | Net1, Nukleolus, Cdc14, RENT, RNA Polymerase I, Saccharomyces cerevisiae |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 32428 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Das Protein Net1 bildet die Kernuntereinheit des nukleolären RENT-Komplexes, bestehend aus Net1, der Histon-Deacetylase Sir2 und der Proteinphosphatase Cdc14. Cdc14 stellt den Gegenspieler der Cyclin-abhängigen Kinase Cdc28 dar. Über seine Phosphatase-Aktivität moduliert Cdc14 den Phosphorylierungszustand von CDK-Substraten und ist am Abbau mitotischer Cycline am Ende der Mitose beteiligt. Cdc14 ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Das Protein Net1 bildet die Kernuntereinheit des nukleolären RENT-Komplexes, bestehend aus Net1, der Histon-Deacetylase Sir2 und der Proteinphosphatase Cdc14. Cdc14 stellt den Gegenspieler der Cyclin-abhängigen Kinase Cdc28 dar. Über seine Phosphatase-Aktivität moduliert Cdc14 den Phosphorylierungszustand von CDK-Substraten und ist am Abbau mitotischer Cycline am Ende der Mitose beteiligt. Cdc14 dephosphoryliert den CDK-Inhibitor Sic1 und seinen Transkriptionsfaktor Swi5, was zur Stabilisierung von Sic1 und zur Aktivierung der SIC1-Transkription führt. Desweiteren vermittelt Cdc14 die Stabilisierung der Anaphase-Spindel, die Kernpositionierung, die Trennung des rDNA-Locus und die Cytokinese. Die Aktivität von Cdc14 wird streng reguliert. Über weite Strecken des Zellteilungszyklus bis zur Metaphase bindet Net1 an die Phosphatase Cdc14 und verankert sie bis zum Metaphase-Anaphase-Übergang m Nukleolus. Net1 bindet hierbei mit seinem N-terminalen Anteil direkt am aktiven Zentrum der Phosphatase. Die Freisetzung von Cdc14 erfolgt über zwei regulatorische Netzwerke, FEAR und MEN.
Über Studien mit verkürzten Net1-Derivaten konnte gezeigt werden, dass ein kleiner Bereich von 196 Aminosäuren in der extremen, N-terminalen Region von Net1 hinreichend für die Lokalisation von Net1 im Nukleolus ist. Dieser Bereich enthält eine unter Net1-verwandten Proteinen wie Tof2 aus S. cerevisiae und Dnt1 aus S. pombe konservierte Region von ca. 75 Aminosäuren, die als pfam10407-Motiv bezeichnet wird. Die Vermutung, dass es sich bei dieser Region um den für die Cdc14-Bindung notwendigen Bereich handelt, konnte über Immunpräzipitationsstudien mit verkürzten Net1-Derivaten widerlegt werde. Das pfam10407-Motiv ist nicht notwendig für die Interaktion mit der Phosphatase. Stattdessen konnte gezeigt werden, dass die N-terminale Region von Net1 DNA-bindende Eigenschaften besitzt und zur Selbstinteraktion fähig ist.
Für die Interaktion mit der Phosphatase Cdc14 sind Bereiche zwischen den Aminosäuren 234-455 hinreichend und notwendig, wie Interaktionsstudien mittels Immunpräzipitation zeigten. Dieser Bereich ist zudem hinreichend, um die Phosphatase-Aktivität von Cdc14 zu inhibieren.
Die bislang wenig untersuchte, C-terminale Region von Net1 ist notwendig, um gesundes Zellwachstum zu gewährleisten. Eine Verkürzung um nur 138 Aminosäuren resultiert in einem starken Wachstumsdefekt. Im Gegenzug kann der Wachstumsdefekt von net1Δ-Stämmen durch die zusätzliche Expression des 138 Aminosäuren großen Fragments abgeschwächt werden. In Net1-Verkürzungsstämmen, in denen die Cdc14-Regulation gewährleistet ist, ist die Expression des kleinen Fragments in der Lage den Wachstumsdefekt vollständig zu supprimieren. Mittels Immunpräzipitation konnte eine Interaktion des kleinen C-terminalen Fragments mit der RNA-Polymerase I-Untereinheit Rpa43 nachgewiesen werden. Auffällig war hierbei die Erkenntnis, dass eine phosphorylierte Form des C-terminalen Fragments mit Rpa43 interagierte.
Zusammengefasst lässt sich das bisher von Net1 gezeichnete Bild um neue Funktionen erweitern. Erstmalig konnte gezeigt werden, dass Net1 direkt mit Nukleinsäuren interagiert. Dies eröffnet möglicherweise einen neuen Blick auf die Art und Weise der Lokalisation an der rDNA. Weiterhin konnte die Region der Cdc14-Bindung auf den Aminosäurebereich 234-455 eingegrenzt werden und dadurch gezeigt werden, dass das in Cdc14-bindenden Proteinen konservierte pfam10407-Motiv nicht die Binderegion für die Phosphatase darstellt. Die C-terminale Region von Net1 vermittelt über die Interaktion mit der RNA-Polymerase I den Wachstums-stimulierenden Effekt.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The protein Net1 is known as core subunit of the nucleolar RENT-complex comprised of Net1, the histone deacetylase Sir2 and the protein phosphatase Cdc14. Net1 plays an important role in regulating Cdc14 activity. Cdc14 antagonizes mitotic CDK activity by modulating the phosphorylation state of CDK substrates and stimulating cyclin destruction by phosphorylating the APC/C specificity factor Hct1. ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The protein Net1 is known as core subunit of the nucleolar RENT-complex comprised of Net1, the histone deacetylase Sir2 and the protein phosphatase Cdc14. Net1 plays an important role in regulating Cdc14 activity. Cdc14 antagonizes mitotic CDK activity by modulating the phosphorylation state of CDK substrates and stimulating cyclin destruction by phosphorylating the APC/C specificity factor Hct1. Cdc14 also dephosphorylates the CDK inhibitor Sic1 and its transcription factor Swi5, resulting in stabilization of Sic1 and Swi5-dependent activation of SIC1-transcription. Furthermore, Cdc14 regulates the stabilization of the mitotic spindle, positioning of the nucleus, separation of the rDNA and cytokinesis. Release of Cdc14 is mediated by two regulatory networks, FEAR and MEN. For most of the cell cycle up to metaphase Net1 binds to the protein phosphtase Cdc14 near its active center and inhibits the phosphatase activity by sequestering Cdc14 in the nucleolus.
Microscopic studies of truncated Net1-derivatives showed, that the first 196 amino acids of the N-terminal region in Net1 are sufficient to mediate its nucleolar localization. This region contains a motif of 75 amino acids, which is conserved in Net1-related proteins such as Tof2 in S. cerevisiae and Dnt1 in S. pombe and was termed pfam10407-motif. It was suggested, that the pfam10407-motif conveys Cdc14 binding in these proteins. Coimmunoprecipitation studies could show, that the pfam10407-motif is not necessary for binding of Cdc14. Instead, the N-terminal region of Net1 shows affinity to DNA and is able to associate with itself.
The region between amino acids 234-455 is necessary and sufficient for binding and inhibition of Cdc14 as shown by immunoprecipitation experiments and in vitro phosphatase assays.
The C-terminal part of Net1 is not well characterized. It is necessary for cell growth as indicated by a truncated version of Net1, where 138 amino acids of the C-terminal region were deleted. These cells show severe growth defects similar to net1Δ strains. Expression of a small fragment containing these 138 amino acids can ameliorate the growth defects of net1Δ mutants. When proper localization and regulation of Cdc14 is ensured the small fragment is able to fully suppress the growth defect. Immunoprecipitation of the small fragment revealed an interaction with a subunit of RNA polymerase I, Rpa43. Interestingly, only a posttranslationally modified and presumably phosphorylated version of the Net1-fragment interacted with Rpa43.
The model of Net1 functions could be extended by this work. Direct binding of Net1 to DNA substrates could be shown for the first time. This finding could influence the view on how Net1 localizes in the nucleolus and organizes nucleolar structure. Furthermore, the pfam10407-motif could be dismissed as the region necessary for Cdc14 binding and inhibition. This function is conveyed by a region between amino acids 234-455 of Net1. The C-terminal region of Net1 contributes to cell growth by binding to RNA polymerase I and stimulating its activity.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 23:35
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