| License: Publishing license for publications excluding print on demand (21MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-326708
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.32670
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 20 October 2016 |
| Referee: | Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Date of exam: | 20 October 2015 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Keywords: | Kv1.4, Kaliumkanal, NMR, zellfrei, S30 E.coli |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 32670 |
Abstract (German)
Ionenkanäle sind integrale Membranproteine, welche den Transport von Ionen durch die Zellmembran gewährleisten. Der spannungsabhängige Kaliumkanal KV1.4 besteht aus vier identisch aufgebauten Untereinheiten, welche eine zentrale Kanalpore im Inneren umschließen. Er besitzt lange Proteinketten, welche ins Cytosol hineinragen und regulatorische Aufgaben für die Kanalaktivität oder die Organisation ...
Abstract (German)
Ionenkanäle sind integrale Membranproteine, welche den Transport von Ionen durch die Zellmembran gewährleisten. Der spannungsabhängige Kaliumkanal KV1.4 besteht aus vier identisch aufgebauten Untereinheiten, welche eine zentrale Kanalpore im Inneren umschließen. Er besitzt lange Proteinketten, welche ins Cytosol hineinragen und regulatorische Aufgaben für die Kanalaktivität oder die Organisation der Zelle übernehmen. Von zentraler Bedeutung für den Kanal ist die KV1.4 T1-Tetramerisierungsdomäne, welche für die tetramere Grundstruktur des Kanals verantwortlich ist. Sie ist direkt unterhalb der Kanalpore lokalisiert und an der Kanalregulation beteiligt. Weitere cytosolische Domänen sind das KV1.4 Ball-Inaktivierungspeptid, verantwortlich für die N-Typ Schnellinaktivierung und der C-Terminus von KV1.4, welcher an regulatorischen Zellfunktionen beteiligt ist. In dieser Arbeit haben wir 15N 1/2H isotopenmarkierte, isolierte cytosolische KV1.4 Domänen unter Verwendung der 2D-NMR Spektroskopie in verschiedenen Zusammenstellungen auf ihre Wechselwirkungen und ihre Bindungscharakteristiken hin untersucht. Zentrale Untersuchungsdomäne war die T1-Tetramerisierungdomäne und ihr wechselseitiges Zusammenspiel mit dem Inaktivierungspeptid und dem C-Terminus. Wir haben gezeigt, dass das Inaktivierungspeptid bevorzugt auf der der Membran zugewandten Oberseite des T1-Tetramers nahe der Kanalpore bindet (AS V73, I77, F75, R69) und einen negativ kooperativen Bindungscharakter besitzt (KD = 13,6-31,2 µM, n = 0,67-0,89). Die gegenseitigen Interaktionsbereiche wurden mittels elektrostatischen Oberflächendarstellungsprogrammen verglichen und ein mögliches Bindungsmodell erstellt. Wir konnten zeigen, dass möglicherweise bereits ein Inaktivierungspeptid zur Inaktivierung des KV1.4 Ionenkanals ausreicht. Der KV1.4 C-Terminus besetzt im Gegensatz zum Inaktivierungspeptid eher seitliche Bereiche des T1-Tetramers (L20, R42, N43, N44; KD = 0,61-0,73 mM; n = 1). Dem bis jetzt als eher unstrukturiert geltenden Protein konnte mehr als ein definierter Konformationszustand (AS Y43-S59) zugesprochen werden. Es konnte gezeigt werden, dass der C-Terminus in der Lage ist das Inaktivierungspeptid von der T1-Domäne partiell zu verdrängen, was eine Beteiligung an der Rückführung des Kanals in den geschlossenen Ruhezustand nahelegt. In diesem Zusammenhang wurde die Bindung zwischen dem Gerüstprotein PSD-95 mit seiner PDZ2-Domäne und dem C-Terminus mit der T1-Domäne untersucht. Der Bindungscharakter konnte näher charakterisiert werden und legt nahe, dass das PSD-95 Gerüstprotein eher nur regulatorischer Funktion ist.
Die zellfreie Proteinsynthese (CFPS) ist eine Methode zur Herstellung von Proteinen in vitro. Das System ist offen und enthält keine Zellwand, was die Möglichkeit bietet zytotoxische oder Membranproteine herzustellen. Das S30 E. coli Extrakt wird lysierten Zellen entnommen und vereint die ribosomalen Translationsbestandteile in sich. Dem CFPS-Ansatz zugegeben werden Transkriptionsfaktoren, DNA-Templates und für die Reaktion nötige Energie und Energieregenerationssysteme. Hauptproblem der zellfreien Proteinexpression ist die geringe Produktivität. Hier wurde ein System mit einer Leistung von 500 µg/ml verwendet. Alle relevanten Bestandteile des zellfreien Systems sind bekannt und wie im PURE-System rekonstruiert herstellbar. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von zusätzlich zugegebenen Translationsfaktoren (IF-1, IF-2, IF-3; EF-Tu, EF-Ts, EF-G, RF-1, RF-2, RF-3, RRF) auf die Syntheseleistung des Systems untersucht. Dabei konnten wir zeigen, dass die Translationsfaktoren im S30-System bereits im optimalem Verhältnis vorliegen. Bei der CFPS laufen stets unerwünschte Nebenreaktionen ab. Eine Möglichkeit diese Nebenreaktionen zu unterdrücken ist die Senkung der Reaktionstemperatur, die allerdings die Produktivität des Systems reduziert. Hierzu wurde die 5`untranslatierte Region (5` UTR) des 'cold-shock' Gens von CspA von E. coli als ein mRNA-leader in die CFPS-Reaktionen eingesetzt. Die Temperatur konnte dadurch reduziert und gleichzeitig die Syntheseausbeute erhöht werden. Die sinkende Enzymaktivität der T7-RNA Polymerase bei tiefen Temperaturen konnte durch Zugabe von T7-RNA Polymerase ausgeglichen werden. Dies ermöglichte eine Synthesesteigerung von über 30 % zum Normalansatz. In einem weiteren Versuch wurde der Einfluss von hydrostatischem Druck auf die CFPS-Reaktion untersucht. Hierbei konnte nachgewiesen werden, dass steigende hydrostatische Drücke die Synthese im CFPS-System inhibieren, die Reaktion bei nachlassendem Druck aber reversibel ist. Ab gewissen Grenzwerten (100 MPa) wird die Funktionalität des CFPS-Systems von anliegendem hydrostatischen Druck jedoch dauerhaft zerstört.
Translation of the abstract (English)
Ion channels are integral membrane proteins, that provide a transport mechanism for ions across the cell membrane. The voltage-dependant potassium channel KV1.4 consists of four identical subunits that enclose a central channel pore. It comprises elongated protein tails, that extend into the cytosol and have regulatory function for the channel activity and cell organization. Of crucial relevance ...
Translation of the abstract (English)
Ion channels are integral membrane proteins, that provide a transport mechanism for ions across the cell membrane. The voltage-dependant potassium channel KV1.4 consists of four identical subunits that enclose a central channel pore. It comprises elongated protein tails, that extend into the cytosol and have regulatory function for the channel activity and cell organization. Of crucial relevance for the potassium channel is the KV1.4 T1-tetramerization domain, controlling the tetrameric architecture of the channel. It is located immediately below the channel pore and contributes to its regulation. Other intracellular KV1.4 domains are the N-terminal 'ball' peptide, responsible for the N-type fast inactivation and the KV1.4 C-terminus, contributing to regulatory cell functions. In this study we examined 15N 1/2H isotope labeled, isolated cytosolic KV1.4 domains by 2D-NMR spectroscopy in varying constellations concerning their mutual interplay and binding characteristics. Central domain of the study was the T1-tetramerization domain and its interaction with the inactivation peptide and the C-terminus. We have shown, that the inactivation peptide prefers binding on the membrane oriented top side of the T1-tetrameric domain (V73, I77, F75, R69) close to the channel pore and displays a negatively cooperative binding character (KD = 13,6-31,2 µM, n = 0,67-0,89). Their mutual interaction areas were compared by an electrostatic surface visualization program and a binding model was developed. It was shown that possibly a single inactivation peptide is sufficient for the inactivation of the KV1.4 channel. In contrast to the inactivation peptide the KV1.4 C-terminus occupies lateral areas of the T1-domain (L20, R42, N43, N44; KD = 0,61-0,73 mM; n = 1). The C-terminus, so far assumed to be an intrinsically disordered protein, was assigned more than one specific conformation state (Y43-S59). It was shown, that the C-terminus is able to partially displace the inactivation peptide from the T1-domain. This suggests a participation of the C-terminus in the transformation of the channel into its initial, active state. In this context a binding between the scaffold protein PSD-95 with its PDZ2-domain and the C-terminus with the T1-domain was explored. The binding character was analyzed closer and suggests a merely regulatory function of the PSD-95 scaffold protein.
The cell-free protein synthesis (CFPS) is a technique for the production of proteins in vitro. The system is open and comprises no cell wall, which enables the synthesis of cytotoxic or hydrophobic membrane proteins. The S30 E. coli extract is extracted from lysed cells and contains the ribosomal translation factors. Transcription factors, DNA-templates and the required energy and energy regeneration systems are added to the CFPS reaction sample. The main challenge of the cell free protein expression is its low productivity. For this study a system with a 500 µg/ml productivity was used. All components of the cell-free system are established and reconstructable as in the PURE system. We investigated the impact of additionally implemented translation factors (IF-1, IF-2, IF-3; EF-Tu, EF-Ts, EF-G, RF-1, RF-2, RF-3, RRF) onto the CFPS productivity and were able to show, that the translation factors in the S30 system have already the optimum composition regarding the productivity. The CFPS is always accompanied by unfavorable side reactions. These side reactions can be decreased by a reduction of the expression temperature, that in turn decreases the productivity of the CFPS. By use of the 5`untranslated region of the cold-shock gene of CspA (E. coli) as a mRNA leader in CFPS, protein yield was increased despite decreasing expression temperatures. The decreasing enzyme activity of T7-RNA Polymerase at low temperatures was compensated by the addition of T7-RNA Polymerase. This enabled an enhancement of the protein yield of more than 30 % compared to the standard reaction. In a further experiment the influence of hydrostatic pressure to the CFPS reaction was studied. Increasing hydrostatic pressure inhibits protein synthesis in the CFPS system, but the reaction is reversible upon release of the hydrostatic pressure. However, above a critical value (100 MPa) the functionality of the CFPS system is destroyed permanently by hydrostatic pressure.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 23:27
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