Die purinen zyklischen Nukleotide cAMP und cGMP sind etablierte „second messenger“ und spielen bei zahlreichen (patho)physiologischen Prozessen eine essentielle Rolle. Die Existenz des pyrimidinen zyklischen Nukleotids cCMP wurde Ende der 1970er Jahre postuliert, konnte aber aufgrund der mangelnden Sensitivität der Methoden nicht eindeutig bewiesen werden. Auch das Vorkommen von spezifischen ...
Abstract (German)
Die purinen zyklischen Nukleotide cAMP und cGMP sind etablierte „second messenger“ und spielen bei zahlreichen (patho)physiologischen Prozessen eine essentielle Rolle. Die Existenz des pyrimidinen zyklischen Nukleotids cCMP wurde Ende der 1970er Jahre postuliert, konnte aber aufgrund der mangelnden Sensitivität der Methoden nicht eindeutig bewiesen werden. Auch das Vorkommen von spezifischen cCMP-interagierenden Proteinen, einer cCMP-spaltenden PDE oder einer cCMP-bildenden Zyklase konnte nicht bestätigt werden. Jahre später gelang es mit verfeinerten massenspektrometrischen Methoden cCMP in vitro und in vivo eindeutig nachzuweisen. Kurz darauf wurde festgestellt, dass in Bakterien sAC und sGC eine Cytidylzyklase-Aktivität aufweisen, d. h. cCMP generieren können. Vor kurzem wurde die spezifische cCMP-abbauende PDE7A1 gefunden und auch zahlreiche cCMP-interagierende Proteine, wie cAK, cGK, MRPs und HCN-Kanäle, wurden identifiziert. Diese Befunde legen die Vermutung nahe, dass cCMP als „second messenger“ an (patho)physiologischen Abläufen beteiligt ist. In der vorliegenden Arbeit wurde das Hauptaugenmerk darauf gelegt, weitere Belege für die „second messenger“-Funktion des cCMPs zu finden. Es konnte bestätigt werden, dass sowohl aufgereinigte cAK, als auch gereinigte cGKI bzw. cGKII durch cCMP aktivierbar sind. Um die physiologische Relevanz des cCMPs weiter zu untersuchen, wurden auch endogene cG-Kinasen in Gewebelysaten mit cCMP konzentrations-abhängig stimuliert. Im weiteren Verlauf der Arbeit konnte mittels cCMP-Agarose Fällungsstudien bestätigt werden, dass cGKI, cGKII und cAK Iÿ/Iÿ/IIÿ reg in verschiedenen Geweben spezifisch mit cCMP interagieren können. Desweiteren wurde MAPK als ein spezifisch cCMP-bindendes Protein identifiziert. Mithilfe von Co-Immunpräzipitationen wurde außerdem gezeigt, dass zwischen cGKIÿ bzw. cGKII und p44/42 MAPK eine Protein-Protein-Interaktion besteht. Stimulierte man die MAP-Kinase direkt mit einem cCMP-Analogon, kam es zu einer erhöhten MAPK-Phosphorylierung, welche bei Zugabe eines cAK-Inhibitors und eines PKC-Inhibitors fast vollständig gehemmt werden konnte. Um die Rolle der cGK in diesem Prozess genauer zu untersuchen, wurde mit cGK-KO-Tieren gearbeitet. Besonders in cGKII-KO-Gewebe konnte eine stark erhöhte MAPK-Phosphorylierung detektiert werden. cGKI-KO-Gewebe zeigte eine verminderte MAPK-Phosphorylierung im Vergleich zum WT-Gewebe. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass cAK und cGKI aktivierend und cGKII inhibierend auf die cCMP-vermittelte MAPK-Phosphorylierung wirken. Somit wird die p44p42 MAPK-Phosphorylierung möglicherweise (neben anderen Vorgängen) über cGMP-abhängige Kinasen reguliert, welche durch cNMPs stimuliert werden. Um eine mögliche pathophysiologische Relevanz des cCMPs genauer zu klären, wurde in Mäusen mittels LPS eine Sepsis induziert und daraufhin im Urin die cNMP-Spiegel vermessen. Hier zeigte sich die Tendenz, dass sowohl cAMP, cGMP, als auch cCMP im Laufe dieser starken Entzündungsreaktion hochreguliert werden. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass cCMP als „second messenger“ im cAK/cGK- und im MAPK-Signalweg wirken und bei (patho)physiologischen Prozessen eine wichtige Rolle spielen könnte.
Translation of the abstract (English)
The cyclic purine nucleotides cAMP and cGMP are established "second messengers" and play an essential role for numerous of (patho)physiological processes. The existence of the cyclic pyrimidine nucleotide cCMP was postulated in the late 1970s, but could not be clearly demonstrated due to the lack of sensitivity of the methods. Furthermore the presence of specific cCMP interacting proteins, a cCMP ...
Translation of the abstract (English)
The cyclic purine nucleotides cAMP and cGMP are established "second messengers" and play an essential role for numerous of (patho)physiological processes. The existence of the cyclic pyrimidine nucleotide cCMP was postulated in the late 1970s, but could not be clearly demonstrated due to the lack of sensitivity of the methods. Furthermore the presence of specific cCMP interacting proteins, a cCMP cleaving PDE or a cCMP forming cyclase could not be confirmed. Years later it was possible to detect cCMP in vitro and in vivo with improved mass spectrometry methods. Also, it was found that in bacteria sAC and sGC have a cytidyl cyclase activity and are able to generate cCMP. Recently, the specific cCMP degrading PDE7A1 was found and also numerous cCMP interacting proteins, as cAK, cGK, MRPs and HCN channels, have been identified. These findings suggest that cCMP is involved in (patho)physiological processes as a "second messenger". In the present work, the main focus was put on finding further evidence of the "second messenger" function of cCMP. It was confirmed that both purified cAK, as well as purified cGKI or cGKII can be activated by cCMP. To investigate the physiological relevance of cCMP endogenous cG kinases in tissue lysates were stimulated concentration-dependently with cCMP. Using cCMP agarose precipitation studies it was confirmed that cGKI, cGKII and cAK Iÿ/Iÿ/IIÿ reg can specifically interact with cCMP in various tissues. Furthermore MAPK was identified as a specific cCMP-binding protein. Using co-immunoprecipitation it was also shown that there is a protein-protein interaction between cGKIÿ or cGKII and p44/42 MAPK. A direct stimulation of the MAP kinase with a cCMP analogue results in an increased MAPK phosphorylation, which was almost completely inhibited when adding a cAK inhibitor and a PKC inhibitor. To investigate the role of cGK in this process, we worked with cGK-KO animals. Especially in cGKII KO tissue the MAPK phosphorylation was increased. Using cGKI KO tissue a reduced MAPK phosphorylation compared to WT-tissue was detected. These results suggest that cAK and cGKI play an activating and cGKII an inhibitory role in the cCMP mediated MAPK phosphorylation. Thus, the p44/p42 MAPK phosphorylation may be regulated by cGMP-dependent kinases, which are stimulated by cNMPs. To clarify a possible pathophysiological relevance of cCMP, sepsis was induced in mice by LPS and the cNMP levels in the urine were measured. Here we showed the tendency that both cAMP, cGMP, and cCMP are upregulated during this strong inflammatory response. These results illustrate that cCMP acts as a "second messenger" in the cAK/cGK- and the MAPK signaling pathway and may play an important role in (patho)physiological processes.
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